利用MTT法测定抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果.doc

利用MTT法测定抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：目的：采用唾哇蓝(MTT)比色法来检测Hela细胞相对数和相对活力，利用已知浓度细胞培养后的吸光度生成细胞成长趋势曲线，从而推测抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果。方法：采用MTT法先测出一组Hela细胞浓度的吸光值的指数方程，同时培养加入不同浓度的顺铂的Hela细胞，最后根据指数方程来计算不同浓度的顺铂抑制后的Hela细胞数量。结果：抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖有抑制效果，不同浓度的顺铂抑制的效果都不一样，几乎呈线性关系。结论：采用MTT法检测有助于指导临床选择化疗药物剂量,提高化疗效果；顺铂对癌细胞的增殖有一定的抑制作用。 关键词：MTT比色法 顺铂 Hela细胞 前言 检测细胞存活与增殖，过去常用的方法有染料排斥法和掺入同位素的释放法。前者易受主观因素影响，误差大后者因放射线同位素污染环境，并需要价格昂贵的仪器设备，整个过程所需时间长，实际应用受到限制。1983年Mos- manntl〕首创了MTT比色分析法，其基本原理是活细胞线粒体脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色甲(Formazan)，从而可用比色法推测活细胞浓度〔1〕。由于MTT法简单、灵敏、稳定;其检测结果与同位素掺入法有良好的一致性，同时又可避免同位素污染及特殊设备的需要，故可代替同位素掺入法，有效地应用于淋巴细胞转化[2j，IL一2[a]，抗肿瘤药物的筛选等研究中。我们以检测抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖活性的抑制效果为例，对MTT法的操作步骤及条件进行了探讨，还探讨一下不同浓度的顺铂对癌细胞抑制效果。 材料与方法 细胞培养 将吹打的单细胞悬液调整细胞浓度约为个/ML，再稀释细胞浓度直到每孔的细胞约为10000个、5000个、2500个、1250个L、625个等这五个梯度，将其接种到96孔板内，一般同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验，同时分别做一组空白对照和一组未知细胞浓度；与此同时，制造一组药物处理组细胞，有调整细胞浓度为20000～30000/ML，每孔接入200ul，使每孔细胞数为5000个左右，最后同时放到培养箱内培养，24～36h后吸掉药物处理组的培养液加入不同浓度梯度的顺铂（1 ug/ml、5 ug/ml、10 ug/ml、15ug/ml）〔2〕各200ul，继续培养。 呈色和比色 培养3天后，所有的孔都倒掉所有的培养液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul,继续培育4h,终止培养，快速翻转培养板，弃去孔内液体，然后每孔加入DMSO150ul，振荡30分钟，使结晶物充分融解。最后选择490mm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。 计算分析 首先，通过excel 软件以吸收光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标曲线；生成接种细胞浓度与吸光值间的趋势曲线与指数方程；然后，按照公式计算各种浓度顺铂处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率=（未知药物处理的对照组吸光值—药物处理组的吸光值）/未知药物处理的对照组吸光值。 2 结果与分析 2.1 不同浓度的顺铂对Hela细胞的抑制效果 表一 不同浓度的顺铂对Hela细胞的抑制率 顺铂浓度/ug/ml 对照组 1 5 10 15 OD值 0.613 0.335 0.269 0.193 0.149 细胞增殖抑制率 -45.35% -56.12% -68.52% -75.69% 如表一所示，各实验组Hela细胞的抑制率不同，顺铂以浓度依赖方式降低吸光度值,与对照组相比均有显著性差异，随着药物浓度的增加,细胞的抑制率也有增加的趋势。说明顺铂能显著抑制HeLa细胞生长增殖,降低细胞活性。对其他实验组的结果，看出在不同浓度的顺铂下，不是浓度越大越好，它是由一定的范围的。所以说明顺铂用药量要看实验的条件或看作用的对象，对于作用的条件、时间、培养条件、操作方式等等都会对影响顺铂的作用效果。所以在应用上一定要很好地限制一切影响条件。 3 讨论与分析 本实验探讨的MTT法测定顺铂对HeLa细胞增殖的抑制作用，借鉴其他实验组的数据，看出不同浓度的顺铂对细胞的抑制效果不同，相对来说，浓度越高，抑制效果会更好，如果应用在患者上，就要针对患者的身体素质来下药，患者的身体素质很好的话，下药量大的话对癌细胞的抑制效果也会越好，但也不是无限量的大，不适合患者的话只会对患者带来严重的副作用。无论是实验动物或癌症患者，使用顺铂后均有不同程度的毒性反应发生，这些毒性