透明质酸酶氧化损伤后聚集体的测定.docVIP

精品论文 参考文献 透明质酸酶氧化损伤后聚集体的测定 胡海云(湖北襄樊职业技术学院医学院，湖北 襄樊 441021) 中图分类号：Q-331 文献标识码：A 文章编号：1673-0992（2010）08-111-01 摘要 :在Cu-Vc体系下，诱导透明质酸酶氧化损伤产生聚集体，并用硫磺素T（Thioflavin T，Th T）染料和刚果红（Congo red，CR）染料两种经典的方法对淀粉样聚集体进行检测。结果表明，Tris-醋酸缓冲体系下，透明质酸酶会由于氧化损伤产生一定程度的聚集体，并且聚集体的产生和反应时间与Cu-Vc的浓度成正比。 关键词：透明质酸酶；淀粉样聚集；氧化损伤 透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）是一种beta;-1-4葡糖胺酸内切酶，是一种小分子蛋白，能特异性分解细胞外基质成分，通过作用于细胞外基质而影响细胞的增殖、分化及迁移，并在胚胎发育和肿瘤发生发展过程中发挥作用[1-2]。目前蛋白质聚集体的形成已成为药物与生物学领域中的研究热点，阿尔茨海默症、Ⅱ型糖尿病等神经退行性疾病都与机体中淀粉样聚集体的形成有关，生成的蛋白质聚集体常导致细胞死亡[3]。本文即采用普通的蛋白质HAase，研究其受氧化损伤诱导所产生的聚集现象[4]。 Th T荧光法和CR光谱法是两种超微量分析技术,也是检测蛋白质淀粉样聚集体的基本分析方法。蛋白质聚集形成纤维后能分别与与荧光衍生剂Th T和CR染料特异地结合，然后分别通过荧光分光光度计和紫外分光光度计测定，探讨其光谱变化与蛋白聚集的状态、聚集体形成的量及反应时间与Cu-Vc体系的浓度之间的关系。 一、材料与方法 （一）材料。 试剂：牛睾丸HAase（EC 3.2.1.35；300 NFU/mg），硫磺素T（Thioflavin T，Th T），刚果红（Congo red，CR），硫酸铜（CuSO4）和维生素C（ascorbic acid，Vc）均购自Sigma公司。其它化学试剂都是国产分析纯，实验用水均为超纯水。仪器：F-4500 荧光分光光度计（Hitachi，Japan）；Cary-100 紫外-可见分光光度计（Varian，USA）；HI-98103 pH计（Hanna instruments，Italy）；BS110S 电子天平（Sartorius，Germany）。 （二）溶液的配制。 Tris-醋酸缓冲液：含10mM Tris，醋酸调节至pH 7.4；Th T用Tris-醋酸缓冲液配成2mM储液，CR用Tris-醋酸缓冲液加10%乙醇配成200mu;M储液，CuSO4和Vc分别配制成1 mM和80 mM的储液，HAase溶于Tris-醋酸缓冲液配制100mu;M储液，储液均用0.22 mu;m的微孔滤膜过滤后遮光冷藏保存，实验中稀释至所需终浓度。 （三）方法 1.诱导聚集体的形成 分别稀释Cu-Vc体系浓度梯度为4mu;MCu2＋-4mM Vc；20mu;MCu2＋-4 mM Vc；80 mu;MCu2＋-8 mM Vc，并配制不含Cu-Vc的对照组，然后在HAase储液中分别加入以上4组Cu-Vc体系，混合稀释至10mu;M终浓度，混合液在37℃下放置达到平衡。 2.硫磺素T荧光法检测聚集体的形成 不同时间取混合液加入Th T稀释至20M，稳定后在25℃条件下测定荧光光谱，扫描300-400 nm范围内的荧光发射谱，测定其482 nm处荧光强度。 3.刚果红染料紫外光谱检测聚集体的形成 不同时间取混合液加入CR使其每3 mu;M蛋白聚集体与10 mu;MCR结合，避光反应30 min，稳定后进行光谱测定。在25℃条件下扫描其在300-700 nm范围内CR紫外光谱，并分别测定同浓度下的CR溶液和蛋白溶液的光谱值，进行空白对照做相应扣除。 二、结果 （一） 硫磺素T荧光法检测蛋白聚集体。 图3-1显示的就是由Cu-Vc体系（Tris-醋酸缓冲体系，80 mu;MCu2＋-8 mMVc，HAase浓度为10 mu;M，反应48 h，Th T终浓度为20M）诱导的HAase产生聚集体与Th T结合产生的荧光光谱。图3-2中显示，改变HAase产生聚集的反应时间和Cu-Vc体系中Cu2＋和Vc的浓度时，Th T荧光法检测到蛋白聚集体产生量的变化。其中A：HAase对照；B：4 mu;MCu2＋-4 mM Vc；C：20 mu;MCu2＋-4 mM Vc；D：80 m