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47卷 3期 微 生 物 学 报 47(3):526一528 2007年6月4日 ActaMicrobiologicaSinica 4June2007 基于皱皮软海绵宏基因组的PKS基因筛选的研究 张戌升，李志勇’，缪晓玲 (上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室 上海 200240) 摘 要:提取皱皮软海绵及其共附生微生物的宏基因组总DNA，使用聚酮合酶(PKS)基因的酮酞合酶(KS)域引物 PCR扩增PKS基因片段获得一条671bp的片段，以pUCm-Tvector为载体将该基因片段克隆到大肠杆菌中，从阳性克 隆中分离出PKS基因片段，测序推导出氨基酸序列。通过BLAST比对发现此氨基酸序列与红细菌 目的 RhodobacteralesbacteriumPKS基因KS域的氨基酸序列有%%的同源性。通过基于氨基酸序列的系统发育分析，推 测此筛选得到的PKS基因属于trans-AT型。本文首次证实了皱皮软海绵中存在细菌来源的PKS基因。 关键词:皱皮软海绵;宏基因组;聚酮合酶基因;PCR扩增;序列分析 中图分类号:Q78,Q933 文献标识码:A 文章编号 “)001-6209(2007)03-0526-03 海绵属于多孔动物门，是最原始的低等多细胞海洋动 Dendy)，采集自我国海南三亚周边20m深海域。由中国科学 物，全世界大约有1000(〕到15001〕种左右，我国据称也有5000 院海洋研究所李锦和研究员鉴定。 种左石。国外研究表明，海绵中存在许多结构新颖的活性物 1.1.2试剂和仪器:Ta，聚合酶为晶美生物工程有限公司产 质，大多在陆地生物中从未发现过，而且很多物质具有广谱 品;大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5。感受态细胞、T4DNA连接 的抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、凝血和溶血等生物活性，是 酶,PCRMarkers均为上海申能博彩生物技术有限公司产品; 潜在的新药来源[i-41。但是绝大多数海绵活性物质的来源 T7,M13引物对和gel,gc2引物对由上海生工生物技术服务 至今还是个谜，几乎全部的海绵活性物质还没有实现大规模 有限公司合成;其余试剂为国产分析纯试剂。HWS24型电 制备，前者是后者的主要限制性因素。目前开展海绵及其共 热恒温水浴锅购自上海益恒实验仪器有限公司;EPS-300系 附生微生物功能基因的研究代表了海洋生物技术的前沿热 列电泳仪购自上海天能科技有限公司;复日FR-980型生物 点，这方面的研究将有助于为解决海洋活性物质制备的瓶颈 电泳图像分析系统购自上海复日科技有限公司;Biofugeprimo 问题找到一条途径。 R型冷冻离心机和HBPX220型PCR仪均购自美国伯乐公司。 聚酮(polyketide)是一类结构多样且具备多种生物学活 1.2 原材料的处理 性的次生代谢产物，被广泛用作抗生素、免疫抑制剂、抗癌 用无菌手术刀切取海绵内部及外部组织少许，装人加有 药[[51。目前已有较多针对海绵及其共附生微生物中聚酮化 适量无菌无钙镁人工海水(CMFSW;31.68NaCl,0.75gKCl, 合物的研究，例如:Abrell等[61从印度尼西亚海绵中分离得到 1.0gMgSO4,2.4gTris-HC1,20mmoYLEDTA,H201L,pH7.0)的 产生聚酮化合物的真菌，Bugni等[71从斐济海绵中得到的细 5mL离心管中，用大口径枪头稍加搅动，并适当吹打;用无菌 菌的发酵液中分离得到新结构的聚酮化合物。相对于从海 钝头镊子撕成lm砰 的小块，于CMFSW中悬浮，用大口径枪 绵中分离得到聚酮化合物，针对聚酮合酶基因的研究最近才 头吹打数分钟，10000r/min,lmin，去上清;加人适量无菌 刚刚开始[[a-101 CMFSW，用大口径枪头吹打重新悬浮，10000r/min,lmin，去上 目前，上海交通大学己经在海绵及其共生微生物的功能 清;加入适量无菌CMFSW，用大口径枪头吹打重新悬浮， 基因研究方面进行了一些