第02章 预处理技术及初步分离 生物分离工程ppt.pptVIP

B) 高压均质法(High—pressure homogenization) 大规模细胞破碎的常用方法。高压均质器主要部件是均质阀和高压泵，利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，喷出后高速(102m/s)冲击撞击环，细胞受到高速撞击作用后, 急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力破综合作用下破碎。 高压均质器中，操作压力高达几十MPa。 高压均质阀结构 高压均质中，对于酵母等难破碎及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。影响细胞破碎的因素有压力、循环操作次数和温度。 破碎动力学方程可表示为 式中 S — 细胞破碎率； k — 与温度等有关的破碎常数 N — 悬浮液通过均质器的次数； p — 操作压力； a ,b — 与微生物种类有关的常数。 对于酵母菌, a=2.9,b=1 对于朊假丝酵母, a=1.7, b=1 对于大肠杆菌, a=2.2, b=1 (2-11) 一般地，增大压力和增加破碎次数都可提高破碎率，但压力增大到一定程度后对均质器磨损较大。试验表明在约175MPa压力下，破碎率可达100％，也有试验表明，当压力超过一定值后，破碎率增加很慢。工业生产中，通常采用压力55～70MPa。 丝状真菌及含有包含体的基因工程菌的破碎，不适合于采用高压均质法，因为易造成堵塞或易损伤均质阀。 此外，不同生长期的细胞以及同种细胞在不同培养条件的细胞在相同破碎条件下的破碎效果也有差异，在快速生长期的细胞较易破碎。 高压均质操作的温升约2－3?C/10MPa，为保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理，多级破碎时需配备换热器进行级间冷却；通过均质器后迅速冷却降温，保护产物活性。 高压均质设备种类较多，最大操作压力可达25－60 MPa，最大处理量可达3－35m3/h。 C) 超声破碎法(Ultrasonication) 超声破碎是应用较多的一种破碎法，通常采用的超声破碎机在15～25kHz的频率下操作。 破碎机理尚未完全清楚，一般认为：与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力。 空穴的形成、增大和闭合，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等有关。超声破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。对不同菌种，超声破碎效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌效果较差。 采用超声破碎法处理少量样品时操作简便，液量损失少，在实验室规模应用较为普遍。 超声波破碎的有效能量利用率极低，操作时产生大量热，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。 超声波振荡易引起温度的剧烈上升，声能传递和散热均有困难。由于对冷却的要求相当苛刻，不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。 此外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而使用范围有一定局限性。 D) 喷雾撞击法 细胞是弹性体，比一般的刚性固体例子难于破碎。将细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎的难度。喷雾撞击破碎正是基于这样的原理。 如下图，细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为每分钟数千℃ ），形成粒径小于50微米的微粒子。高速载气(如N2，流速为300m/s)将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。 喷雾撞击破碎的结构 与珠磨法和高压均质法相比， 本方法中，细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象 细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收。 喷雾撞击破碎适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液质量浓度为100－200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50－500mL，而工业规模的连续处理能力在10L/h以上。 针对目标产物的性质（如相对分子质量、 分子形态、稳定性等），选择合适的细胞破碎法，并确定适宜的破碎操作条件是非常重要的。 如核酸相对分子质量很大，破碎中易受剪切损伤。 利用高压均质、珠磨、超声波和喷雾破碎等数种机械破碎器破碎大肠杆菌，提取质粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整质粒收率在90％以上，而其他方法的收率低于50％。 非机械利用化学或生化试剂处理细胞，改变细胞壁或细胞