黄芩提取物抗登革病毒Ⅱ型的体外实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 黄芩提取物抗登革病毒Ⅱ型的体外实验研究 洪文艳 唐博恒 刘金华 刘建伟 王珊珊 方美玉（广州军区疾病预防控制中心疾病监控科 51050） 【摘 要】 本实验以白纹伊蚊C6/36细胞为宿主细胞，阿昔洛韦为阳性对照药物，通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT法来测定一种黄芩提取物的细胞毒性、药物对DENV-Ⅱ的直接灭活作用、以及药物抗DENV-Ⅱ对细胞的吸附和对DENV-Ⅱ在细胞内复制增殖的抑制，并算出药物抗 DENV-Ⅱ的治疗指数。实验结果显示该药物在体外细胞模型中对DENV-Ⅱ无直接灭活作用，最大无毒浓度为4.0 mg/ml，半数中毒浓度TC50为20.1 mg/ml，也基本无抗DENV-Ⅱ吸附细胞的作用，在达一定药物浓度时能抑制DENV-Ⅱ在细胞内的复制增殖，半数有效浓度IC50为4.0mg/ml，治疗指数约为5。 【关键词】 黄芩；抗病毒作用；登革病毒Ⅱ型；体外实验 黄芩是一味临床常用的中药，中医认为黄芩味苦、性寒，归肺、心、胆、肝、胃、大肠经；具有清热燥湿，泻火解毒，止血等功效；主治湿热内蕴，呕吐，热淋，肺热咳嗽咯痰，痈肿疔疮等。近年来随着对其活性成分黄芩苷及黄芩素的深入研究，发现黄芩根提取物尤其是黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛、抗氧化及清除氧自由基等作用。在我国南方包括广东广西海南等地流行的登革病毒感染性疾病的临床治疗中也会用到双黄连口服液、银黄注射液等含有黄芩的中药制剂[1,2]。本实验就是基于上述基础，试图通过体外细胞实验模型对有关黄芩提取物抗登革病毒感染的治疗作用及机理进行研究。 1 实验材料 1.1 黄芩提取物 由武汉大学医学院病毒研究所提供，生药液浓度为200mg/mL，抽滤除菌后-20℃保存，实验用时以细胞维持液稀释成不同应用浓度。 1.2 白纹伊蚊C6/36细胞 本实验室传代保存。细胞生长液：DMEM培养基加10%新生小牛血清，常规加100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素，1%谷氨酰胺。细胞维持液：除血清降为2%外其余同生长液。 1.3 DENV-Ⅱ标准毒株 由本实验室保存。病毒经C6/36细胞活化增殖,细胞病变效应(cytopathogenic effect; CPE)达+++以上时收获。实验测得其TCID50约为10ndash;6。 2 实验方法 2.1 药物的细胞毒性测定 将细胞接种96 孔板，置30 ℃、5%CO2培养箱中培养，长满成单层后弃上清，换用含药维持液继续培养。药液浓度依次为1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0 mg/mL，每浓度重复3孔，同时设正常细胞对照及阳性药物对照（ACV,1.0ug/ml)。逐日观察CPE并记录，记录按通用标准：- ：无细胞病变；+：25%以下的细胞出现病变；+ +：25% ～50%的细胞出现病变；+ + + ：50%～75%的细胞出现病变；+ + + +：75%～100%的细胞出现病变。待各组CPE稳定（约5～7天）后用改良MTT法检测各孔细胞存活率。改良MTT法操作步骤参照文献[3]：每孔加入MTT（5mg/mL）20ul，30℃继续培养4h，后轻吸弃各孔内上清，每孔加入150ulDMSO，振荡混匀10分钟，使结晶充分溶解，测定570nm波长处吸光值(OD570)。细胞存活率(%)=药物组的OD值/正常细胞组OD值times;100%，并用直线回归法算出药物对细胞的50%毒性浓度(TC50)。 2.2 药物对病毒的直接灭活作用 将100TCID50的病毒液与药液等体积混合，药物终浓度在已测得的最大耐受浓度以内，分别为0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mg/mL，每浓度重复3 孔,在CO2培养箱中于30 ℃下温育2 h后，将3 份同浓度样品混匀，用维持液进行连续10 倍的递次稀释，按参考文献[4]方法测定病毒的TCID50。 2.3 药物对病毒吸附细胞的阻断作用 待96孔板内的细胞长满成单层后，弃上清，加含药维持液0.1ml/孔，药物终浓度同2.1，每浓度重复3孔，同时设未用药的病毒对照及正常细胞对照。培养24 h后弃上清，用PBS洗细胞1 次，再接种100TCID50病毒0.1ml/孔,30 ℃吸附2 h，再弃上清，换维持液继续培养细胞。每日观察CPE并记录。 2.4 药物对病毒在细胞内复制增殖的抑制作用 待96孔板内的细胞长满成单层后，弃上清，100TCID50病毒0.1 ml/孔，30 ℃