实验一 相差显微镜的使用.docVIP

实验一 相差显微镜的使用 一、实验目的 掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。 二、实验用品 试剂：蒸馏水或生理盐水。 器材：相差显微镜（相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜、绿色滤色镜）、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、指甲油。 三、实验原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位指在某一时间上光的波动所能达到的位置的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化相应发生的差异即相差，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差明暗差，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜通常标有PH的标记代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。相差装置卸下普通显微镜使用的聚光器将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 旋转集光器转盘，将对准标示孔，使普通聚光器进入光路。打开光源，拔出目镜，插入合望远镜，一边从望远镜内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上。×PH=20倍，正反差，反差程度高 40×PM=40倍，正反差，反差程度中等 100×PL=100倍，正反差，反差程度低 40×NH=40倍，负反差，反差程度高 40×NM=40倍，负反差，反差程度中等 100×NL=100倍，负反差，反差程度低 100×DH=100倍，暗反差，反差程度高 40×DM=40倍，暗反差，反差程度中等 20×DL=20倍，暗反差，反差程度低 10×BH=10倍，明反差，反差程度高 20×BM=20倍，明反差，反差程度中等 40×BL=20倍，明反差，反差程度低 相差物镜应用范围 标示 反差 应用 P 正 观察细胞或细胞内部结构 N 负 观察微小物体如孢子、鞭毛和活的样品 H 高 样品本身反差低的 L 低 样品本身反差高的 M 中 样品本身反差中等的 六、实验步骤 1.取一张洁净的载玻片，滴一滴生理盐水或蒸馏水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许与水混匀，盖上盖玻片。 2.10×相差物镜旋入光路。 3.将相应于10×相差物镜的聚光器环状光阑移入光路中，完全打开聚光器孔径光阑。 4.将样品置于载物台上，聚焦样品。 5.调节聚光器。 6.观察物镜后焦面，调节环状光阑的像和相板中圆环互相吻合。具体方法：取下一个目镜，插入聚焦望远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰的环状光阑和相板的像。 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。 七、结果与讨论 在相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。 八、作业与思考题 1.概述环状光阑的亮环与相板的暗环、合轴、调焦法。 2.用明反差与暗反差物镜分别观察同一物体，阐述其物象的区别。 3.相差显微镜有哪些特有部件，构造如何。 4.明反差与暗反差相板的构成及其原理。 5.相差显微镜的光路图。 6.相差显微镜为什么要用绿色滤色镜。 7.为什么相差显微镜可以直接观察活体样品。