基因工程与技术.docxVIP

绪论基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质 DNA双螺旋结构和半保留复制机理 遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定基因工程的特征：1. 跨物种性2. 无限扩增 组成：上游和下游技术基因工程研究的基本任务：开发人类需要的基因产物，这样的基因叫做目的基因。连接酶连接机理：a) ATP/ NAD+ + DNA 连接酶(E)→ E-AMP + PPi/NMNb) E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶c) 活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，并释放出AMP特点：（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）3）需要能量分类：大肠杆菌DNA连接酶 T4 DNA连接酶 热稳定 DNA连接酶影响因素：温度（粘性末端的Tm值，连接酶活性的最适温度。经常采用12.5℃（4-15℃）） DNA浓度（外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍） 环化（碱性磷酸酶预先处理质粒载体。）T4 DNA聚合酶：1、它是一种模板依赖的DNA聚合酶2、3’ →5’DNA外切酶活性，可以将5’端突出末端补平或3’端突出末端削平。外切酶活性对于单 链DNA更高。 3、T4 DNA Polymerase的3→5外切酶活性比Klenow要高约200倍。Klenow：1、双链DNA5’突出末端的补平与标记；2、双链DNA3突出的打平(也称削平)；3、随机引物法进行DNA标记；4、cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链 的合成。TdT聚合酶：末端脱氧核苷酸转移酶；是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3‘羟基端；它的优选底物是3突出端，但也可以添加核苷酸至钝末端或凹陷的3末端多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端生成ADP的反应。DNA聚合酶分为： ①依赖于DNA的DNA聚合酶； ②依赖RNA的DNA聚合酶大肠杆菌：5′→ 3′聚合，3′→ 5′和 5′→3′外切。主要用途：切口平移法制备DNA探针T4DNA聚合酶：5′ →3′聚合活性； 3′ →5′外切活性，对单链活性大于双链 DNA，外切酶活性比Klenow大200倍用途：在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切；只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸；在四种dNTP均存在时，聚合活性T7DNA聚合酶（测序酶）： 5′ →3′聚合，持续反应时间最长，单链、双链DNA的3′ →5′外切，是DNA 聚 合酶Ⅰ的 1000倍。无5` →3`外切酶活性。用途主要用于长模板的引物延伸！Taq DNA 聚合酶：具5′ →3′外切活性 。用途：PCR反应。测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。逆转录酶：5’ 3’ 聚合酶活性，RNA酶H活性，5’或3’方向用途： ①合成cDNA第一链，构建cDNA文库； ②RT-PCR； ③以RNA为模板制备DNA探针；修饰酶：甲基化酶 乙基化酶 碱性磷酸酶等2、限制性核酸内切酶限制修饰系统（R-M）：存在于细菌等一些原核生物体内，可保护自身免于外来DNA（如噬菌体）侵入的一个系统，包括限制和修饰两个方面的作用。?限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解；? 细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的 外来DNA则会被降解。 ? 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解限制性核酸内切酶的分类：I型限制性内切酶II型限制性内切酶?III型限制性内切酶识别序列的结构：1、回文结构2、不是回文对称结构。3、有一些限制酶可识别多种序列4、稀有限制性内切酶终止酶切的方法：一：用试剂盒纯化 DNA；二：加入loading buffer，跑胶;三：加热-65℃ 或 80℃ 处理 20 分钟 或 用苯酚抽提去除蛋白；四：EDTA可螯合镁离影响限制性内切酶活性的因素：1. 酶的纯度2. DNA样品纯度3. DNA甲基化程度（dam甲基化酶、dcm甲基化酶）4. 缓冲液条件5. 酶切反应温度6. DNA分子结构2星号活性：极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性引起星号活性的原因：①高甘油含量，大于5%； ②酶用量过大，大于100U/微克DNA； ③低离子强度，小于25mmol/L； ④高pH，大于8.0； ⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等； ⑥Mn2+ 、Cu2+ 、Co2+ 、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子的存在。切 口 酶：有些限制酶只切割双链 DNA 中的一条链，产生单链缺口。在命名时前面要加一个 N，如 N.BstNBⅠ。3、载体基因克隆的质粒载体 ： 复制起点、选择性标记、多克隆位点（MCS）质粒的不相容性：不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主