转基因小鼠技术PPT.ppt

* * 16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠 Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个研究小组--- 2001获得了Lasker奖 17. 1996年 -- “百慕大法则” 公共基因组序列数据 18. 1998年?-- 克隆鼠 1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。 15. 1983年 -- PCR Kary Mullis --1993年的诺贝尔奖 小鼠的历史 转基因小鼠技术 ---转基因小鼠的构建 * 基因打靶的简易程序 * 优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 胚胎干细胞（ES细胞）法 * * * * 主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。 3、逆转录病毒感染法 * * 显微法和克隆法效率比较 1997 Nature 385, 810–813 4、体细胞核移植法 * * 优点 减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。 事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力,具有很大的优越性。 缺点 体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基础理论和实验技术上还需进一步探索。 4、体细胞核移植法 * * 5、精子载体法 将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植,这样产生的动物也会使外源基因得到表达。 精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法 * * 优点 基因转化方法简便,效率高 动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点 目的基因整合的随机性 无法早期验证修饰事件 成功率不高、效果不稳定 5、精子载体法 * * 6、YAC法（人工酵母染色体法） 优点： 克隆百万碱基对(Mbp) 级的大片段外源DNA 的能力,可以保证巨大基因的完整性; 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变; 保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高; 鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效率。 缺点： 不稳定，制备工艺繁琐。 * * 7、BAC法（人工细菌染色体法） 建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可300kb。 F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。100kb,近百个蛋白质。 可构建BAC文库； 有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre 重组酶； BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的 染色体定位； 可稳定遗传，易于操作。 BAC文库：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC?大肠杆菌 * * 方法 显微注射 核移植 胚胎干细胞 逆转录病毒 基因敲除 精子介导 优点 外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb 转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术 外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 该方法简单、方便 缺点 精密仪器， 技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变 供体细胞易衰老 ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 应用具有一定局限性 有些结果不能重复 基因转移方法的比较 * * Electroporation * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 * * 1 2 5 6 4 3 * * * * * * * * 转基因小鼠技术---转基因小鼠在科研中的应用 * * 1. 7500万－1.25亿年前 -- 人鼠始祖 小鼠的历史 2. 19世纪 -- 宠物鼠---实验鼠的“先驱” 3. 1897年 -- 重组表型 * * 4. 1900年 -- 从宠物鼠到实验鼠 Abbie Lathrop----饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传学研究。哈佛大学---老鼠的毛色进行观察，以检测孟德