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医学论文-ILKsiRNADNA表达载体的构建 ?????????????????? 作者：李敏侠，刘必成，张露，张晓良? 　?[摘要]目的：构建针对整合素连接激酶（ILK）mRNA的小干扰RNA（siRNA）表达载体，为抑制ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其功能奠定基础。方法：合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环结构，与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的Psilencer 3.1质粒连接，大肠杆菌中扩增，测序鉴定。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明Psilencer 3.1酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有64 bp的插入片段，其序列与所设计、合成的ILKsiRNA转录模板序列一致。结论：siRNA转录模板完整正确地插入Psilencer 3.1质粒中。 ??? [关键词]小干扰RNA；质粒；整合素连接激酶；构建 ? 自1998年Fire等[1]用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术阻断特定基因的表达以来，RNA干扰（RNA interference，RNAi）已发展成为一种经济、快捷、高效抑制基因表达的有力工具。siRNA是一种19个碱基互补配对、两端分别有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默复合体（RNA induced silence complex,RISC）。在其中一条RNA链的引导下，RISC特异性降解与siRNA同源的mRNA[2]。siRNA制备方法有多种，各有其优缺点，但若是在哺乳动物细胞内持续稳定表达siRNA,长久抑制靶基因，以小的茎环结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体的方法和稳定筛选的技术最为有效[34]。整合素连接激酶（integrin linked kinase,ILK）是Hannigan等[5]于1996年首先发现的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelialmesenchymal transition,EMT）中发挥了重要作用[6]。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体，用此载体转染肾小管上皮细胞株，为应用RNAi技术抑制ILK表达,进一步研究ILK在肾小管EMT中的作用提供物质基础和技术支持。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 材料Psilencer 3.1 H1 Hygro 即用型线性质粒购自Ambion公司，全长4 552 bp,两端分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并且带有潮霉素(hygomycin)和氨卞青霉素(ampicillin)抗性，适合进行稳定筛选。T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自大连TaKaRa公司。菌株JMα由东南大学黏细菌发育研究室惠赠。ILKsiRNA转录模板[7]由上海申能博彩公司合成，RNAi ILK目标序列为5′TGACGAAGCTCAACGAGAA3′。 ??? 1．2? 方法 ??? 1．2．1? 茎环结构的设计? 所设计茎环结构序列长度为64 bp的反向重复序列,两端带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，中间被9 bp环结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，形成BamHⅠ＋Sense＋Loop＋Antisense +终止信号＋HindⅢ的结构。序列如下：正义链，5′GATCCGTGACGAAGCTCAACGAGAATTCAAGAGATTCTCGTTGAGCTTCGTCATTTTTTGGAAA3′；反义链，3′GCACTGCTTCGAGTTGCTCTTAAGTTCTCTAAGAGCAACTCGAAGCAGTAAAAAACCTTTTCGA5′。 ??? 1．2．2? 单链ILKsiRNA转录模板退火变成双链? 将合成的单链正义siRNA转录模板和单链反义siRNA转 录模板用无菌双蒸水稀释成1 μg?μl-1,分别取2 μl，加46 μl退火缓冲液，配成50 μl缓冲体系，置90 ℃ 3 min，缓慢降温至37 ℃， 37 ℃恒温1 h 。 ??? 1．2．3? ILKsiRNAPsilencer表达质粒构建? 取5 μl退火反应液，加45μl无核酶去离子水，将退火后siRNA转录模板稀释成8 ng?μl-1,取1 μl与线性空载Psilencer 3.1质粒1 μl、T4 DNA连接酶1 μl、连接缓冲液1 μl、无核酶去离子水6 μl构成10 μl反应体系，置8 ℃过夜。以不含Psilencer 3.1的10 μl连接反应体系作为对照。连接产物转化感受态大肠杆菌JMα,在含80 μg?ml-1氨卞青霉素平板上37 ℃生长过夜。非转化大肠杆菌涂布