医学论文-川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经细胞凋亡的影响.docVIP

医学论文-川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经细胞凋亡的影响 【摘要】? 　　目的： 探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内核转录因子-κBp65 (NF-κBp65)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响。方法：使用青霉素致痫大鼠模型, 采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电, 待癫痫样放电稳定后, 腹腔注射TMP, 待其抑制作用最明显时, 取大脑切片,观察大脑神经元内NF -κBp65蛋白表达的变化。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NF-κBp65蛋白的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果： TMP组大脑神经元内NF-κBp65蛋白表达的平均光密度及阳性面积率显著低于模型组, 差异有显著性 (P0.01)。 结论： TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元有重要的保护作用。 【关键词】? 川芎嗪 癫痫放电 神经元 青霉素 NF-κBp65 　　癫痫是以大脑神经细胞群反复超同步放电引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱为特征,以反复痫样发作为表现的临床征候群,其发病机制尚未完全阐明。癫痫致脑损伤已被许多动物实验和临床观察所证实,神经细胞凋亡是最近发现的癫痫脑损伤又一途径,虽出现较晚,但却能持续存在。川芎嗪, 化学结构为四甲基吡嗪( tet ramethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动, TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降［1］,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用［2，3］。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病［4］的治疗。??? 　　NF-κB广泛存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽,与免疫、肿瘤的发生发展、细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系,是一种重要的核转录因子。目前,对NF-κB的研究已成为一个非常引人关注的领域［5］。??? 　　本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内NF-κBp65蛋白的表达及平均光密度及阳性面积率的变化影响,进一步探讨TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元作用的机制。 　　　　1?? ???料与方法?　　1.1? 材料?　　1.1.1? 实验动物? SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供) , 雌雄不拘, 体重200～ 250g。?　　1.1.2? 实验药品及试剂? 盐酸川芎嗪注射液(批号0107001) , 常州制药厂生产；注射用青霉素钠( 批 , 华北制药股份有限公司生产。?　　1.1.3? 实验仪器? BL-410 生物机能实验系统, 成都泰盟电子有限公司生产；江湾I-C型立体定向器, 第二军医大学器材处生产。?　　1.2? 方法?　　1.2.1? 癫痫动物模型? 实验选用健康SD大鼠,用10%乌拉坦以10m l·kg-1体重腹腔注射( ip ) 麻醉, 将动物固定在江湾I-2C型立体定向器上,于大脑左、右两侧前卤后3mm,矢状缝旁开3mm 行开颅手术, 暴露大脑皮层记录区域(2mm×2mm),将银球电极置于左、右两侧的记录部位,信号输入置BL-410生物机能实验系统, 进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)置于左侧大脑皮层表面, 诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电, 待癫痫放电稳定后, 移去明胶海绵, 用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。?　　1.2.2? 试验分组及取材? 将实验大鼠随机分为3组, 每组10只: ①A 组(对照组) , 麻醉开颅手术1h后取大脑; ②B组(模型组),青霉素诱发癫痫1h后取大脑； ③C组(TMP组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射TMP(20mg·kg- 1),待抑制作用最明显时取大脑。?　　1.2.3? HE染色? 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。?　　1.2.4? 免疫组织化学S-P法检测NF-κBp65蛋白相关抗原??? 　　主要步骤：??? 　　① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；??? 　　② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；??? 　　③ Bcl-2采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；??? 　　④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；??? 　　⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；??? 　　⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；???