实验四、基因组dna的提取和检测(阳成伟).pptVIP

实验四、基因组DNA的提取 准备：一次性手套、 65℃水浴锅、氯仿、无水乙醇、1.5离心管、菜花 实验目的： 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。 2.了解基因组DNA的实验用途。 3. 掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 材料：花椰菜/昆虫组织 设备：移液器，高速离心机，水浴锅，培养箱 。 试剂： 1. CTAB组织消化液 2. 氯仿 3. 无水乙醇 4. TE缓冲液 CTAB溶液配制 2%CTAB溶液：100mmol/L Tris-HCl, pH7.0；1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA；2%CTAB. ? 10 ml final conc.（终浓度） CTAB 0.2 g 2% H2O 5.78 ml ? 1 M Tris-HCl 1.0 ml 100 mM 5 M NaCl 2.8 ml 1.4 M 0.5 M EDTA 0.4 ml 20 mM 实验原理（CTAB法） CTAB，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可使细胞破裂，释放出核酸； CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解释放出来的DNA （ DNA在2mol/LNaCl中DNA具有较高的溶解度）； 加入无水乙醇，可以使DNA从溶液中沉淀出来。 实验步骤（常温操作，2人一组） 取适量(300-500mg)植物组织，加入2ml CTAB抽提缓冲液，充分匀浆2-3min，然后每人转移700ul的匀浆液至一支1.5ml离心管中，65℃水浴45min（中间摇动2-3次）（裂解细胞，释放核酸和蛋白）； 加入700ul的氯仿，上下摇动2-3min (此步是萃取组织液中的蛋白质；务必带上手套！）； 12000rpm离心10min，取400ul上清液转移至一支1.5ml离心管中（由于此时悬液已经分层，而我们需要取最上层的溶液，所以注意千万不要使枪头触碰到中间的杂质层，当然，更不能取吸取下层的萃取液了）； 加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下颠倒3-4次混匀；然后再加入2倍体积的无水乙醇（0.9ml)，上下颠倒3-4次混匀（如DNA量大，此时可见絮状DNA沉淀。（如果放置于-20度过夜，DNA产率会更多！） 12000rpm离心5min，缓缓倒掉上清液（剩余的液体可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（无色透明胶状物！）； 加入200ulTE缓冲液（含50ug/ml RNase），轻弹管底，以溶解DNA；也可以用枪头缓慢地来回吸放液体来帮助溶解DNA。此时应该可以看到片状的DNA沉淀物逐渐变少，最终消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否则影响电泳效果！）； 将DNA溶液置于37 ℃ 培养箱或水浴中30min（降解残留的RNA） ； -20 ℃ 保存备用。 取5~10ulDNA（加适量loading buffer）电泳检测；取2ulDNA测定浓度和OD260/280（下次课电泳检测）。 基因组DNA的检验（纯度） 紫外分光光度法： 核酸在260nm处有最大吸收峰 蛋白质在280nm处有最大吸收峰 盐和小分子在230nm处有最大吸收峰 1.7OD260/OD2801.9 OD260/OD2302.0 基因组DNA的检验（完整性） 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 材料质量 （mg） 100 300 500 100 300 500 所加TE体积（ul） 200 200 200 400 400 400 260/280 2.03 1.97 1.92 2.07 2.02 2.01 260/230 2.10 2.31 2.19 2.05 1.95 2.02 浓度（ng/ul） 254.5 454.4 569.5 139.6 262.1 320.0 上样2ul 上样8ul 注：1-6序号分别与表中对应。 核酸的贮存——DNA保存 1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液(PH为8.0)，可减少DNA脱氨反应；EDTA可以抑制DNase的活性。 2）长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年； 无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，减少分子间的排斥力，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 基因组DNA提取的用途 构建基因组文库 So