重组D氨基酸氧化酶的表达、纯化与固定化.pdfVIP

D一氨基酸氧化酶基因工程茸的表达／yLi-T程的研究 重组D一氨基酸氧化酶的表达、纯化与固定化 研究生： 林欣 指导教师： 王秀武扬晟 学科专业： 细胞崖物擎 摘要 是生产制茵中间体-氨基头孢烷酸(7-ACA)的一种具有重要工业价值的—科鹰，用已 经构建￡斑Vn蚺。的表达载饰I加在大肠杆菌中经乳糖诱导发酵表达，获得的菌体 提马女糨瞰，经以粥匕为基质的树且静_ⅢAo—蹴化后，于25℃，5％C阳蒹伊F检 测，每升勰黝瀚酶}舌为29)00U，缬《t匕活为16u徊昏纯f{二了16倍，缡的收率为70％。 ；|钮)AAo缏彝}瘦f固定j酮嗥树月弘I曲％舯∥E，固定4七西§的酉酾达到142IJ／g，能够链 续10|必割{二J静防而酶活没有明显损失，对底物的转化率达到粥％以上。本文实验数据表 明，D从。经亲和县析后固定到环氧载1牡可为其应用于工业当中提供}良好拓州罐径。 我f门构建了透明颤萄血红蛋白(vilreiosdⅡam∞幽蚰，VHb)基因与IⅧAAO 基因的融合基因，来确认细菌血红蛋白能否作为固定化D丸‘o酶的荤【雠执而提高 nu旧酶}i性。我们设计Ⅵ西的引物，并引入Njo堆[点，用P(璁方法扩增出v】曲基因， 将其克隆至岫u珀_3中D～均基因的前端获得表达载体pIX01，通过测序，序列正确，将 pLX01与翱积押H蠼因脚)嘲质粒同时做诱导表排对照，表达}刮彤徽有明显提 高。 为获得新的DAA0基因，用RT-Pa坊法从粘红酵母(Rh0由幻n11a卸词is)中获得 DAAO的c￡}NA并将其克隆到pF同玎(A)载体匕，将重组质粒转化到大肠杆菌Ⅸ{5a中， 筛选到重组劂蛳R5同mAAo，抽取质粒转岫yss胆L21∞B耀暖态细胞，得到重组 大肠杆菌卣啪Ⅸ02。在诱导温度为30℃，诱导菌株初始浓度为0D∞08，诱导剂矸盼 浓度为lmlvI时，能够检测到DMO活力。 关键词：n氨基酸氧化酶发酵纯化固定化 6 D_氨基酸孙匕酶基因工程菌的表达及酶工程的研究 文中缩写 DAAO D-Amino-Add-Oxidase (D-氮基酸氧化酶) C Cephlalospor／n (头孢菌素C) GDZ菇(秘 acid 7-glutarylcephalosporanic 戊二酰基．7喜淫敦孢烷酸 √4詹叠。五4(：4 d-ketoadipyl-7·aminocephalosporanic a．酮酸已二醣7-氨基头孢烷酸 7ACA acid 7-aminocephalosporanic (7-氨基头孢烷酸) 皿TG isopropylthio-[5-D-galactoside (异丙基一D二D-半乳糖苷) 7 肛氨基酸氧化酶基因工程茵的表达及酶工程的研究 部身谊剂的配置 分子实验所用试剂 1．10×程lB曲erliter) Tris 121．19 Bor地cid 51359 EDTANa2．2H20 3．729 2 50X脚liBr)： THs