基因工程菌的构建.PPTVIP

分子生物学实验 一、实验设计 二、实验操作 指导教师：林 凤 基因工程菌的构建 载 体 目的基因 载体与目的基因的连接 1、粘末端 2、平末端 3、对照实验 连接产物的转化 1、核酸电泳检测 2、对照实验：空白和阳性 阳性重组子的鉴定 1、限制性酶切法 2、α-互补法 3、插入失活法 4、杂交筛选法 construction of expression vector 实验操作 碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18 接种子液至75 μg/ml Amp的5 ml LB培养基 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定 DNA的酶切与连接 酶切反应体系 1 2 ddH2O 19μl 19μl 10×buffer 2.5μl 2.5μl 质粒DNA pBR322 3μl pUC18 3μl EcoRI 0.5μl 0.5μl 37 ℃，1 h 65 ℃，10－15 min终止反应 取4μl 样品，加入10×Loading buffer 0.5μl ，核酸电泳 重组DNA的转化 （一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 0.3 ml菌种接种于30 ml LB培养基 转化子DNA的快速鉴定 PCR扩增技术 * * 实验设计 酶切 PCR扩增，酶切 载体片段 目的基因片段 + 连接 重组质粒 转化 重组子阳性鉴定 1、载体多克隆位点 2、缓冲溶液 3、温度 4、末端的性质 酶切位点设计 NcoI CCATGG GGTACC XhoI CTCGAG GAGCTC 37 ℃ ，OD600 1.0 加氯霉素 100 μg/ml 37℃，过夜 1.4 ml培养液 4℃, 6000 rpm, 2 min 沉淀加100 μl 冰预冷溶液Ⅰ,剧烈振荡 弃去上清，尽可能除净培养液 室温，20 min 200 μl 新配制溶液Ⅱ，快速颠倒混匀 冰浴5 min 150 μl 冰预冷溶液Ⅲ，温和振荡 冰浴5 min 上清加入450 μl饱和酚，混匀 4℃, 12,000 rpm，2 min 上清加入450 μl氯仿-异戊醇，混匀 4℃, 12,000 rpm，2 min 上清加入300 μl异丙醇，-20℃，30 min 4℃, 12,000 rpm离心5 min 500 μl 70% 乙醇洗涤沉淀 4℃, 12,000 rpm，2 min 弃上清，空气干燥10 min 20 μl TE溶解质粒DNA 4℃, 12,000 rpm，5 min 连接反应体系 ddH2O 8.5μl 10×buffer 4.5μl 酶切DNA pBR322 20μl 酶切DNA pUC18 10μl T4 DNA ligase 1μl 16 ℃，15 h 取10μl连接产物，核酸电泳（上步剩余酶切产物做对照） 其余连接产物用于转化 37 ℃ ，190 rpm OD600 0.375，冰浴10 min 4℃, 6000 rpm, 10 min 弃上清，加4 ml冰预冷 0.1M CaCl2 冰浴10 min， 4℃, 6000 rpm, 10 min 弃上清, 加入1 ml 0.1M CaCl2，分装200 μl/管 （二）转化反应 分别加入连接产物20 μl, 阳性对照质粒pBR322 1 μl, 阴性对照pUC18 1 μl, 空白对照 冰浴30 min 42 ℃, 90 s 冰浴1-2 min 弃500 μl 上清, 连接产物取100 μl , 10 μl各涂一平板, 空白，阳性对照和阴性对照200 μl各涂一平板 加入800 μl LB培养基 37 ℃水浴5 min 37 ℃，缓慢摇，复苏45 min 37 ℃，12-16 h 观察转化子的出现 6000 rpm, 5 min