十二叶绿素的定量测定分光光度法.doc

实验二十 叶绿素含量的测定 叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。 方 法 Ⅰ 目的 掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。 二、原理 叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。 2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。 3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。 四、实验步骤 1. 叶绿素的提取 称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。 2. 测定 取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。 五、计算 将测得的吸光度A652 值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。 A652 C ( mg ·ml－1 ) = ———— ……………………………………………………（1） 34.5 公式中： C — 叶绿素 （a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 ) A652 — 表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度 34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。 C（mg·ml－1）× 提取液总量（ml） 叶绿素含量（mg ·g－1Fw）= ———————————————— ……（2） 样品鲜重（g） 方 法 Ⅱ 目的 掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。 二、原理 叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、 b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式： A663 = 82.04 Ca + 9.27Cb …………………… ( 1 ) A645 = 16.75 Ca + 45.6Cb …………………… ( 2 ) （1）、（2– 2.69 A645 …………………… ( 3 ) Cb=22.9 A645 – 4.68 A663 …………………… ( 4 ) CT =Ca + Cb= 20.21 A645 + 8.02A663 ……………………( 5 ) Ca、Cb为叶绿素a 、b的浓度, CT为总叶绿素浓度，单位：（mg · L－1） ，.利用上面( 3 )、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a 、b及总叶绿素浓度。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片 2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。 3. 试剂：80﹪乙醇。 四、实验步骤 1. 叶绿素的提取 从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g (可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙醇 10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。 2. 测定 取光径为1cm的比色杯，加入叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。 五、结果计算 将测定得到的吸光度 A663、A645值分别代入上面( 3 )、( 4 )、（5 ）式计算出Ca 、Cb及 CT (即叶绿素a 、b 及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a 、b及叶绿素总含量。 Ca × 提取液总量 (ml) 叶绿素a 含量（mg ·g－1Fw）= ————————————— 样品鲜重（g）× 1000 Cb × 提取液总量 (ml) 叶绿素