Bac to bac 表达说明书.docVIP

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）的技术（Luckow et al., 1993），利用细菌转座子原理，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统，意即从细菌（bacterium）到杆状病 毒（baculovirus），革命性地改变了重组昆虫杆状病毒的构建方法。 其基本原理为：将一个改造后的AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能在细菌中复制（由于太大，只限单拷贝），将其称之为杆状病毒穿梭载体 （baculovirus shuttle vector，又称病毒质粒 baculovirus plasmid，将其首尾合写而成为Bacmid），通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。杆状病毒穿梭载体Bacmid含有细菌单拷 贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。在lacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子 Tn7整合所需的靶位点（mini-att Tn7），但它的插入不影响lacZα基因的表达阅读框。将杆状病毒穿梭载体（130kb）转化入大肠杆菌DH10β,获得转化子将其命名为 DH10Bac。因此，杆状病毒穿梭载体像一个大质粒一样，可以在大肠杆菌中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性，且与存在与受体菌染色体上的lacZα缺 失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Blue-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑（lacZ+）。 重组Bacmid通过pFASTBAC供体质粒（donor plasmid）上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒（helper plasmid，13.2kb）的功能作用下将外源目的基因插入到Bacmid中来完成。Helper plasmid表达转座酶并含有四环素（tetracycline）抗性基因。pFASTBAC系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动 子（polh或p10启动子），在mini-Tn7左右臂间由一个完整的表达框，包括庆大霉素（gentamincin）抗性基因、杆状病毒启动子、多克 隆位点及SV40 poly(A)。外源基因插入到杆状病毒启动子下游的多克隆位点，将此重组的供体质粒转化入含还有helper plasmid和Bacmid的DH10Bac中，由mini-Tn7转座子将供体质粒上的表达框插入到Bacmid的靶位点，破坏lacZα基因的表 达。在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的培养板进行筛选，重组的Bacmid（即重组病毒基因组）转化体菌落呈白色。而非重组Bacmid转 化菌落依然为蓝色。因此可以通过菌落的颜色进行重组病毒的筛选。通过单菌斑的培养，抽提得到重组Bacmid基因，随后转染入昆虫培养细胞获得重组病毒， 即可进行重组蛋白的表达生产。 利用位点特异性转座作用将外源基因插入到能在大肠杆菌增殖的穿梭载体Bacmid，实现重组病毒的构建，该方法的优点在于：（1）由于重组病毒的分离是通 过蓝白斑筛选，不存在野生型和非重组型病毒污染的问题，因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒；（2）大大地缩短了重组病毒构建所需要的时间。因 此，该技术可以快速、同时分离多种重组病毒。这是一种目前最快速简捷地生产重组病毒的方法。作为一种新型的表达系统,因为其许多特有的优势特点, 逐渐引起了人们越来越多的关注 特点能对高效表达的蛋白质进行较完善的翻译后加工,如糖基 化,磷酸化,酰基化,信号肽的切除等; 与其他真和细胞表达系统相比能获得重组蛋白的高水平表 达,最高甚至可达到细胞总蛋白的50%; 对脊椎动物无感染性,并且也已经证明它们的启动子在大 多数的哺乳动物细胞中也是没有活性的,因此这对于表达 一些致癌基因和潜在的毒蛋白比其他的表达系统更有优势; 能容纳大分子片段的插入和表达; 能同时在一个细胞和载体上表达多个外源基因; 能保证高表达的外源蛋白在细胞内进行正确的折叠,二硫 键的搭配等. 基本原理 AcNPV为环状双链的DNA病毒,分子量在 90～130kd,是目前应用最广泛的杆状病毒 表达载体.其中的多角体蛋白(Polyhedrin) 对于感染过程不是必需的,因此可以用一 个外源基因来代替多角体蛋白基因,用这 样一个重组的杆状病毒来感染昆虫细胞, 从而实现目的蛋白的高效表达. 为了在昆虫细胞中表达外源基因,重组病毒 质粒的构建和纯化筛选,常常需要依赖基 本的转染和斑点分析方法,这个过程通常 会花费4～6周.然而,如果利用一个既能 在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行复制 的,又能感染敏感的鳞翅目昆虫细胞的病 毒穿梭载体(bacmid),那么就可以将周期 降低到几天. 小结杆状病