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光谱校正原理和常见问题 研发部 宋欣欣 光谱校正原理 GoldenEye16A Matrix Standard简介 Matrix校正3100常见问题及解决方案 光谱校正原理 荧光和荧光物质 何为Matrix？ DyeSet/FilterSet 评价Matrix的参数 Mixture of dye-labeled PCR products from multiplex PCR reaction Sample Separation Sample Detection CCD Panel (with virtual filters) Argon ion LASER (488 nm) Color Separation Fluorescence ABI Prism spectrograph Capillary Sample Injection Size Separation Processing with GeneScan/Genotyper software Sample Interpretation Figure 13.8, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press 荧光和荧光物质 什么是荧光？ 某些物质吸收特定波长的光能量，使分子从基态(S0)转化成激发态(S1) 。 被激发的分子通过内部转化过程失去能量，重新回到具有最低能量的基态。 分子回到基态的同时，发射出更高波长的光——荧光。 染料 激发波长Excitation max.(nm) 发射波长Emission max.(nm) 化学名称 6-FAM 495 535 6-carboxy-fluorescein HEX 529 560 4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein JOE 526 548 6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxy-fluorescein VIC 538 554 TAMRA(TMR) 559 578 carboxy-tetramethylrhodamine NED 553 574 ROX（CXR） 580 605 6 - Carboxy - X - rhodamine 常用荧光物质 FAM (blue) HEX (green) TAMRA (yellow) ROX (red) Figure 13.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press 520 540 560 580 600 620 640 WAVELENGTH (nm) 100 80 60 40 20 0 310 Filter Set A with color contributions FAM HEX TMR ROX Laser excitation (488nm) Normalized Fluorescent Intensity Figure 13.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press Figure 13.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press 染料 filterSet 何为Matrix？ -修正不同染料发射光谱之间叠加的一个数学矩阵 3100的Matrix 5×20 横向：20个Bin 纵向：5 dye DyeSet FilterSet Virtual Filter 决定CCD上的哪部分区域被激活，相应部分的可见光被收集 DyeSet/FilterSet 评价Matrix的参数 Q值： Pull-up峰和Pull-down峰 Q值表示得到的matrix与理论值间一致性的参数。Q值为1.0表示实际matrix与理论值完全相符，无任何pull－down或pull－up峰。 minQ表示对pull-up或pull-down峰的容忍度。默认值为0.95。进行光谱校正后，软件会自动计算得到每根毛细管的Q值，Q值小于minQ（0.95）时，校正失败。 评价Matrix的参数 C值 表示染料组合中各染料发射光谱的重叠程度。 若染料峰间无重叠，则C值为1.0,为最低可能值。随重叠程度增加，C值相应增大。 ConditionBounds是由两个作为范围的上下限的C值组成，形式如[4,7]