分子生物学论文miRNA-143过表达转基因小鼠建立.doc

分子生物学论文 题 目miRNA-143过表达转基因小鼠的建立 姓 名 所在学院 专业班级 学 号 指导教师 日 期 年 月 日 得 分 Title miRNA-143过表达转基因 小鼠的建立 Introduction miRNA，即MicroRNA，是新近发现的一类广泛存在于真核生物中的内源性单链小分子非编码RNA，其不编码蛋白质，本身不具有开放阅读框（open read frame，ORF）。长度约为17～22个核苷酸（nt），具有高度的保守性、细胞组织特异性、时序性及位相性特征。此类RNA可通过参与基因转录后水平的调控，从而影响靶基因的表达，迄今为止，已发现数百种miRNA与人类密切相关，其中多种miRNA在调控心血管疾病的进程中不可或缺，正引起国内外学者的极大关注。定位于18号染色体上的miRNA-143作为脂肪组织表达丰度较高的miRNA之一，在脂肪细胞的分化过程、脂肪代谢以及调控血脂水平中扮演着重要角色。 miRNA-143在脂肪细胞分化过程中扮演重要角色，Esau等发现在人前体脂肪细胞和小鼠3T3-L1前体脂肪细胞的诱导分化过程中，miRNA-143的表达均逐渐上调，且可能通过其靶基因ERK5发挥作用。而转染miRNA-143反义寡核甘酸进入脂肪细胞后则会减少三酰甘油的累积和脂肪细胞分化特异性基因PPARc2、aP2和GLUT4的表达，证明miRNA-143有促进脂肪细胞分化的作用。同时它还可能与肥胖、IR（肥胖和2型糖尿病等疾病的共同病理基础）、血管平滑肌（vascular smooth muscle cell，VSMC）的分化和增殖等多种病理生理状态有关。 Objectives 主要目标： 建立miRNA-143过表达转基因小鼠模型； 观察miRNA-143在过表达转基因小鼠脂肪组织中的表达情况。 分目标： miR-143过表达转基因小鼠载体构建； 受精卵前核显微注射法将载体到注射到受精卵中。 Hypothesis 促分化成熟的3T3-L1脂肪细胞表达miRNA-143； miRNA-143及其靶基因的表达利于实验模型的建立。 Research contents 肥胖是一种由遗传、环境等多种因素相互作用导致的慢性代谢性疾病，其中遗传因素对肥胖的发生起着重要的作用。近年研究显示，肥胖者与正常体重者的miRNA表达谱存在较大差异，其中miRNA-143可能是与肥胖发生密切相关的miRNA之一。另一方面，在基因治疗中，miRNA应用的潜力远远优越于干涉RNA序列或反义寡核苷酸。Ox-LDL（脂肪细胞经氧化低密度脂蛋白）是一种重要的致动脉粥样硬化性因子，体内的动脉粥样硬化进程也少不了脂肪组织和细胞的参与，它吞噬低密度脂蛋白亦可成为泡沫细胞，进而肥大，增殖，坏死并分泌致动脉粥样硬化性炎症因子或脂肪因子，最终促使整个人体的生理机能紊乱逐渐发展成为糖尿病、代谢综合征、高血压、冠心病等。 为了更多的探究肥胖、高血压及冠心病等疾病，本实验选择miRNA-143这一脂肪细胞中表达丰度最高的miRNA和小鼠脂肪细胞作为研究对象。 实验方案： miR-143过表达载体的构建 从miRBase数据上搜索找到miR-143序列，设计引物，用于克隆。 miRNA-143过表达转基因小鼠 利用受精卵前核显微注射法将miRNA-143过表达载体导入小鼠受精卵中，获得miRNA-143过表达转基因小鼠模型。 PCR法检测转基因小鼠的整合情况 实时定量PCR法检测miRNA-143过表达转基因小鼠脂肪组织中miRNA-143及其靶基因的表达情况。 6. Expected Results miRNA-143过表达转基因小鼠，与同窝阴性鼠相比，miRNA-143在过表达转基因小鼠脂肪组织中的表达升高，miRNA-143靶基因表达水平下降，则成功构建miRNA-143过表达转基因小鼠。 流程图 饲养1周 转染 腹腔注射5U PMSG