rt-pcr检测外周血中肝癌细胞.docVIP

浅谈　　摘要: 应用rt-pcr技术检测外周血中肝癌细胞是近年发展起来的新方法，白蛋白mrna和afp mrna为肝组织特异表达，通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血的标记，有助于判断肝癌的转移、复发。本文综述了近年有关这方面的研究进展。 　　肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, hcc.以下简称肝癌）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在肝切除术后和肝移植术后再发率仍达50％以上1。因此，多数学者认为在手术之前患者外周血中已存在肿瘤细胞或已发生微转移而影像学诊断又未发现；也有学者推测可能是手术过程导致了肝癌的细胞播散。肝癌细胞的血源性播散是肝癌肝外转移的主要方式，所以在治疗前检测外周血中是否存在肝癌细胞可能是患者肿瘤复发、转移和预后的重要指标。近年兴起的逆转录酶-聚合酶反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, rt-pcr）具有敏感性高、特异性强的优点，使检测外周血中的少量癌细胞成为可能，国外学者已相继报道利用rt-pcr技术在多种实体瘤患者外周血中成功地找到肿瘤细胞2。本文集中对外周血中检测肝癌细胞的研究作一综述。 　　1 原理和方法 　　rt-pcr技术是以rna为模板，在逆转录酶的作用下，由人工合成引物介导生成cdna第一链，以此再作为聚合酶链反应的模板，在taq dna聚合酶作用下，扩增产生大量特异dna片段。检测外周血中肿瘤细胞的依据是：由于血浆中富有大量的rna酶，一旦血浆中出现rna即会被降解，故血浆中不会有游离的mrna，因此通过rt-pcr技术检测到的mrna显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mrna是决定检测结果是否可靠的重要因素。目前，由于缺乏肝癌特异表达的mrna，因此，肝组织特异性表达的白蛋白mrna和甲胎蛋白（α-fetoprotein, afp）mrna被用于肝癌细胞的检测。 　　rt-pcr技术检测外周血肝癌细胞的一般步骤如下3,4,5：静脉取血去除红细胞，收集有核细胞用于提取总rna，或用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞，癌细胞与单核细胞在同一密度层。异硫氰酸胍一步法提取细胞总rna。rt-pcr反应，分为一次pcr和套式pcr。结果检测，简单方法是电泳分离染色观察扩增带；为增加试验的敏感性和特异性，更多学者采用分子杂交的方法确定阳性结果。 　　2 外周血白蛋白mrna的检测 　　carr等在1991年美国肝病研究协会第42届年会上首次报告利用rt-pcr技术检测白蛋白mrna以确定外周血中的肝癌细胞，结果表明在17例晚期患者中16例阳性，其中6例肝移植术后外周血白蛋白mrna水平降低甚至消失，而2例术后白蛋白mrna水平不变的患者出现肿瘤复发。同时检测的6例健康对照、10例肝硬化患者及10例肝硬化行肝移植术的病人均为阴性6。hillaire和黄智铭等也得到相似的结果，统计学分析表明白蛋白mrna阳性率与肝癌的临床分期、肿瘤的转移、复发相关3,7。 　　随着更多实验室开展外周血白蛋白mrna的研究，越来越多的资料表明白蛋白mrna作为肝癌患者外周血中癌细胞的标志是不适宜的，其表现在三个方面：首先，在良性肝病、健康对照人群发现不同程度的阳性检出率。louha5、chou8、　matsumura10、muller9、wong11、ng12等人的结果证实了这一点，他们分别在5例、6例、8例、26例、9例、3例健康对照的外周血中检测到白蛋白mrna；同时，muller9的结果还表明在慢性肝病组织阳性率为88％（22/25），急性肝病组织为94.7％（18/19）。其次，部分良性肝病患者切除术后外周血白蛋白mrna呈阳性。 ijzermans13等对5例良性肝病患者切除前后分析表明，术前外周血中均无白蛋白mrna转录，而术后24h内均阳性，作者认为白蛋白mrna可能是由于手术操作导致正常肝细胞释放进入血液循环造成的。其三，外周血白蛋白mrna阳性与肝癌患者临床资料不相关，无临床指导意义。barbu14等将101例肝病患者依是否外周血中转录白蛋白mrna分为二组，比较二组间肿瘤大小、 个数、有无门静脉瘤栓及肝外转移等各项临床资料，统计学分析表明二组间无显著差异（注：二组患者的治疗方案无显著不同）；随访一年两年组间的存活期也无显著差异。 　　综上所述，利用蛋白mrna作为外周血肝癌细胞存在的标记是有争议的，一些学者指出这种差异可能是由于各实验室所使用的方法及灵敏度不同造成的。我们比较了不同文献的方法，其灵敏度在不同实验室也有较大差异，导致在不同患者组中检出率也不相同，最后所得结论也就不可避免是相反的。同时，我们也注意到各作者进行灵敏度分析时所用的肝癌细胞（系）是不同的，这就更难精确比较不同作