微生物设计实验.doc

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 　　1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 　　2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 　　3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 　　4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 ??? 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 　　要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源 分离对象 分离方法 稀释度 培养基名称 培养温度/℃ 培养时间/d 土样 细菌 稀释分离 10-5，10-6，10-7 牛肉膏蛋白胨 30～37 1～2 土样 放线菌 稀释分离 10-3，10-4，10-5 高氏1号 28 5～7 土样 霉菌 稀释分离 10-2，10-3，10-4 马丁氏琼脂 28～30 3～5 面肥 或土样 酵母菌 稀释分离 10-4，10-5，10-6 马铃薯葡萄糖 28～30 2～3 细菌分离平板 细菌单菌落 划线分离 10-2 牛肉膏蛋白胨 30～37 1～2 　三、实验材料 　　1. 菌源土样 　　2. 培养基??? 牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录。?? 　　3. 无菌水??? 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。??? 　　4. 其他物品??? 无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 　　1. 取土样? ??? 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液? ??? 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。 　3. 接种? ??? 分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。 ??? 从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至45～50左右的相应培养基，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，2～5天后，观察菌落情况及计数。 1.包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤 　4. 培养 ??? 冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。 　　5. 计数? ??? 选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。 表2-2? 样品中四大类微生物的菌落数 采样 日期 ? 采样地点 ? ? 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 平均每克样品所含微生物数 细? 菌 ? ? ? ? ? ? 放线菌 ? ? ? ? ? ? 酵母菌 ? ? ? ? ? ? 霉? 菌 ? ? ? ? ? ? （二）涂布法分离（酵母菌定量分离用） ??? 依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右