药品微生物检查法的验证.ppt

lb-04-12-24 药品微生物检查法的验证 许华玉 国家药典委员会 2005.11.11海南 菌种的要求 菌种的安全性问题 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物特性。 试验菌株保存时，应采用适宜的保存技术，防止试验菌株发生变异。 菌液制备方法 菌液制备可采用不同的方法，新鲜菌液的制备常用的方法有两种。即液体培养物直接稀释法和细菌标准浓度比浊法。 液体培养物直接稀释法 取试验菌的新鲜培养物少许接种于9～10ml的液体培养基中，按要求的温度和时间培养后作为原液。取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）。测定活菌数采用平皿计数法。 细菌标准浓度比浊法 取试验菌的新鲜培养物少许接种于琼脂培养基或液体培养基中，按要求的温度和时间培养后备用。取琼脂培养基上的培养物于适宜的稀释剂中制成均匀的菌悬液；液体培养物一般要比标准比浊管的浓度稀，同时培养基的颜色也影响比浊的结果，所以可采取离心集菌，去掉上清液，底部培养物再用适宜的稀释剂制成均匀的菌悬液。将上述菌悬液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，此时的菌悬液作为原液。比较浊度时，应注意光线的强度，并从各个角度比较，以保证测定的菌数是在要求的范围内，然后根据标准比浊管的说明书，取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数小于100 cfu。采用平皿计数法测定活菌数。 注意事项 ⑴ 对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的实验人员的测定结果的可能有很大的误差，甚至达到50%。所以，在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。 注意事项 ⑵ 当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。 注意事项 ⑶ 为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度，将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管应接触试管内壁并靠近液面（勿接触液面），缓慢地沿管壁放出全部菌液，然后，将吸管放入消毒液中。再取一支灭菌吸管同法往下稀释。 注意事项 ⑷ 对于液体培养物直接稀释法，若同一个实验人员在菌液培养、稀释和测定菌数时均采用一致的操作方法，那么每次的菌数测定结果基本可保持在一定的范围内，经多次试验后可确定此范围。对于细菌标准浓度比浊法，由于采用肉眼观察、对比菌液管与比浊管的浊度，容易造成误差，因此，就无法保证每次菌数能控制在要求的范围内。在药品微生物试验中，所加的阳性菌数均要求在一定的范围内，并要确定所加的菌数，因此当加菌试验应和菌数测定同时进行时，采用液体培养物直接稀释法基本上能保证了试验所加的菌数是在要求的范围内，避免因菌数不符合要求而重新进行试验。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cf的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。 枯草芽孢杆菌菌液的制备 接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu（一般稀释至1∶105）的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。 生孢梭菌菌液的制备 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。菌数测定采用血琼脂培养基平皿法或硫乙醇酸盐流体培养基试管法。 白色念珠菌菌液的制备 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,23～28℃培养24～48小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu（一般稀释至1∶105）的菌悬液。菌数测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。 黑曲霉菌液的制备 接种黑曲