PCR技术(DW).ppt

常用分子生物学及软件下载网址;;; 余 兴 龙;参考书;PCR技术的创建;专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器 ;DNA的结构;DNA的双螺旋结构; Each time a cell divides into two daughter cells, all the DNA molecule must be duplicated. Duplication of an old DNA molecule into two new DNA molecules is called Replication. During replication, the DNA helix is unraveled and its two strands are separated. An area known as the replication bubble forms and progresses along the molecule in both direction. Then each DNA strand serves as a template for the synthesis of a new complementary strand.  Each daughter DNA molecule is an exact copy of its parent molecule, consisting of one old and one new DNA strand. Thus the replication is semi-conservative;;引物;三篇重要论文;什么是PCR;1个DNA分子扩增30、35和40个循环后其分子数分别是1.07×109 、3.44×1010和1.099×1012;;1-3泳道分别是从1个，2个和5个细胞中扩增的人类肌动蛋白cDNA，C泳道为阴性对照; 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，即利用DNA聚合酶通过引物延伸DNA的某个特定的区域而进行的重复双向DNA合成。其过程共包括模板DNA变性、退火和延伸三个步骤。每一循环的产物可作为下一个循环的模板, 这三步周而复始地循环进行使被扩增的DNA片段的量呈指数级增加。这样经过的一定数量的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。利用这一技术可以很容易将一段基因复制为原来的十亿甚至一千亿倍。 ; 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。;1). 变性(?Denaturation)：将DNA加热变性，?使双链DNA加热后变成单链DNA以便它与引物结合作为复制的模板。一般加热到92—96℃使DNA变性，变性DNA所需要的时间决定于DNA的复杂性、反应管的导热性能、PCR仪的种类和反应的体积。对于G十C含量高的DNA序列，加入甘油、DMSO、延长变性时间可以提高PCR产量。在多数情况下，94℃、30秒即可达到有效变性。;2).?退火(Anneal)?：?Primers在一定的温度下与变性模板DNA的互补序列配对结合。这一步的温度从37℃到72℃都有，由引物的长度和碱基组成及与靶序列的同源性程度而定。引物以显著大于靶序列的浓度存在，长度也短于靶序列，因而它们与互补序列的配对速度比靶序列重新配对成双链的速度快几个数量级 ;3). 延伸(?Extension?)：?在DNA聚合酶?(e.g.?Taq)?的作用下以两引物间的DNA片段为模板，以dNTP为反应原料，按碱基配对原则与半保留复制原理，进行引物的延长合成新的DNA 分子。这一步通常在72℃进行，所需要时间主要由DNA产物的长度和聚合酶的催化速率决定。 ;PCR的要素：参加PCR反应的物质有五种引物、