即ve=vo+vipptdesign对某物质在凝胶柱内洗脱体积ve.pptVIP

按层析的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 　　 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 　　 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 　　 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 凝胶层析是六十年代初发展起来的一种快速而 又简单的分离分析技术，凝胶层析法又被称分子 排阻层析法、尺寸排阻层析法、体积排阻层析法、 分子筛层析法等等。 2）性能特点： （1）外观颜色：白色珠状凝胶。 （2）溶胀性： 交联度不同，膨胀度、吸水量、分级范围以及颗粒大小有很大不同。型号：G—10、G—15、G—25、G—50、G—75、G—100、G—150、G—200。 G表示凝胶，数字为得水值，即吸水量。G—10表示1g凝胶吸水1ml。得水值越大，凝胶的孔径越大。 （3）物理稳定性： 稳定，可耐高温、高压灭菌处理。 （4）化学稳定性：稳定，在水、盐、碱、弱酸、强酸稀溶液、有机溶剂中稳定。但在强酸或氧化剂存在时可使糖苷键断裂。易受微生物污染，室温长期保存需加防腐剂。 （5）机械强度：交联度越高，机械强度越高。 G—10、G—15是刚性的， G—25、 G—50也可。其他的则差。 （6）吸附性： 新购的对蛋白质具有不可逆吸附作用。 3）用途 （1）脱盐：通常使用的是G—10~G—50，因为它们的孔径小，蛋白质不能进入凝胶内，只有盐离子可以进入。所以可以将蛋白质与盐分开。 （2）分离提纯蛋白质：（G—75，G—200） 1）、结构： Sepharose为束状琼脂糖以氢键交联成的立体网状颗粒。按其浓度分为Sepharose2B（2%）、 Sepharose4B（4%）和 Sepharose6B（6%） 交联琼脂糖（ Sepharose CL)，为琼脂糖与1，3-二溴异丙醇交联成的，Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sepharose CL-6B孔结构不变，对热的稳定性有所提高。 2）性质 （1）稳定性：热不稳定（60℃即开始熔化）。 （2）机械强度：同类产品不同型号性质有差异。如Sepharose4B比2B机械强度大，但网孔小。 Sepharose CL比同型的Sepharose机械强度高。 3）用途：多用于分离纯化分子量达几百万的分子和颗粒，如病毒、核酸和多聚糖。 四、基本操作 1，凝胶的选择与预处理 （1） 型号选择：使分离物的分子量包含在其分离范围内。 （2） 颗粒大小的选择：一般用中粒100-200目。 颗粒小，分离效果好，但流速慢；颗粒大，流 速大，但分离效果差。 （3） 凝胶用量的计算： g=Vt/膨胀度 2)水中膨化 不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短，在20℃条件下需3～4 h；但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1～5 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。 3）排除凝胶中气泡 膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡 。 3.装柱 1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要捧除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。 5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡。 6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。 7） 柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍柱体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。 通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重