非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(egfr)基因突变检测方法建立和临床应用word论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 要 肺癌的发病率和死亡率居于恶性肿瘤的首位，其中约 80%是非小细胞肺癌 （Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）。分子靶向治疗被认为是治疗晚期 NSCLC 的主要方法，而表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor， EGFR）则是目前最主要的靶点，但临床上使用的 EGFR 靶向药物并非对所有患 者都有效， EGFR 敏感突变则是药物有效的前提。2011 版的 NCCN 非小细胞肺 癌指南中明确指出，晚期 NSCLC 患者应先检测 EGFR 基因的突变状况，若有 EGFR 基因敏感突变，优先推荐 EGFR-TKI 治疗。外周血循环 DNA 因具备肿瘤 细胞 DNA 的一些特征，并且取材方便、创伤小和能实时检测而成为临床研究的 热点。本论文主要分以下两部分内容。 第一部分，人 EGFR 基因突变检测方法的建立。 目的：建立一种能够快速、敏感、特异、简便检测人 EGFR 基因突变的方法。 方法：首先，利用分子克隆技术及 Fast Mutagenesis System 原理，联合质粒 连接、转化构建人 EGFR 基因的 4 种野生型和 29 种突变型质粒，并将构建质粒 的测序结果与 NCBI 数据库的序列进行比对。 其次，采用 Primer Express 3.0 软件设计人 EGFR 基因 29 种突变质粒的 ARMS 特异性引物及检测目的序列的 Taqman 水解探针，并经过反复实验筛选、确定， 进而确定、优化反应体系及确定判定标准并验证其检测灵敏度、特异性、检测限。 最后，用所建方法检测 100 例临床石蜡组织样本的 EGFR 基因并根据划定的 判读标准判读结果，然后与焦磷酸测序结果进行比对，验证该方法的可行性。 结果：①构建完成的人 EGFR 基因的 4 种野生型和 29 种突变型质粒的序列 与 NCBI 数据库序列完全一致，即完成质粒构建。 ②最终筛选并确定的ARMS引物和Taqman探针能够进行特异性扩增，即PCR 产物的电泳结果显示全部为目的大小的条带。已建方法的检测灵敏度、特异性和 检测限达到检测要求，最后划定的Cutoff △Ct值见表10。 ③所建方法及确定的判读标准检测 100 例临床石蜡组织样本得到的结果和 焦磷酸测序结果完全一致，该法可行。 结论：本研究建立的 PCR-荧光探针法是一种灵敏、特异、简便的人 EGFR 基因突变检测方法，有实用参考价值。 III万方数据 III 万方数据 第二部分，探究所建方法检测外周血 EGFR 基因突变临床应用的可行性。 目的：通过对晚期 NSCLC 患者的配对组织和血浆中的循环 DNA 进行 EGFR 基因突变检测，探究所建方法检测血浆 DNA EGFR 基因突变临床应用的可行性。 方法：从 50 例晚期 NSCLC 患者的肿瘤组织和血浆中提取 DNA，使用已 建的 PCR-荧光探针法对其进行 EGFR 突变检测，评估两样本中基因突变的一致 性。 结果：50 例肺癌临床样本，在外周血样本中：检出 S768I 1 例， T790M 1 例， L858R 4 例， Ins 1 例， Del 5 例，共计突变 12 例，总突变率为 24%；在 石蜡组织样本中：检出 S768I 2 例， T790M 1 例， L858R 6 例， Del 5 例，共 计突变 14 例，总突变率为 28%；其中有 3 例组织样本能检测到突变而配对外周 血样本不能，有 1 例外周血样本能检测到突变而配对组织样本不能；两样本 EGFR 基因突变的一致性为 92%。 结论：血浆循环 DNA 与相对应的肿瘤组织 DNA 的 EGFR 基因突变类型一 致性较高，部分 NSCLC 患者的肿瘤组织难以获得，这种简便且微创地检测血浆 循环 DNA 的方法很有可能取代组织而应用于肺癌 EGFR 基因突变的诊断，从而 指导临床治疗。 本论文突出之处：本论文将 ARMS 技术和 Taqman 技术结合，建立了实验室 快速检测人 EGFR 基因的突变检测方法，而且探究了该法对外周血 DNA 检测的 适用性，为以后临床应用打下了基础。 关键词： 非小细胞肺癌； 表皮生长因子受体； 基因突变； 扩增阻滞突 变系统； 循环 DNA PAGE 4万方数据 PAGE 4 万方数据 ABSTRACT Lung cancer is a malignant tumor with the highest incidence and mortality, and in the cases of lung cancer, non-small cell lung cancer (Non-Small Cell Lung Cancer,