荧光定量PCRPPT.ppt

PCR 反应体系的建立及优化： SYBR Green 使用浓度：太高抑制了Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2 的浓度：可以降低到1.5mM，以减少非特异性产物 反应Buffer体系的优化 反应温度和时间参数：由酶和引物决定 其他与常规PCR相同 SYBER GREEN 法的 优缺点 方法二：TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对时 ，发生 FRET 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 TaqMan 探针图示 TaqMan 探针工作原理图示 TaqMan PCR反应的建立和优化 引物探针的设计： 探针Tm为68-70度，30bp，5’不能有G，G可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针，扩增片断 400bp，引物Tm为59-60度 2.反应参数的确定： 一般为：95度，3min 94度，15s 60度，60s 40 cycles (Taq酶5’---3’外切酶活性在60度最高也可通过温度梯度优化退火温度) 3.优化引物和探针浓度：获得最小Ｃｔ值，最大信号／背景比值 　　引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4.其他与常规ＰＣＲ同 TaqMan方法的优缺点 方法三：分子信标 分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环 结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构 中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的 淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被 激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭 剂，这一过程称为荧光谐振能量传递 （ FRET ）。由于 “ 黑色 “ 淬灭剂的存在，由 荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式 释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其 释放能量的波长与荧光基团的性质有关。 分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子 荧光定量PCR技术的应用 (1)?病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。  Morris 等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究，测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组，另外，他们还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种方法检测均为阳性，10例均为阴性，另外6例用两种方法测定的结果不一致，该六例样品让第三个实验室采用巢式PCR方法重新测定，结果与FQ-PCR结果一致。 (2)基因表达研究：细胞因子是一种对免疫反应、炎症反应具有重要的调节蛋白，这些低分子蛋白由淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞所分泌，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥反应等有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用荧光定量PCR检测细胞因子mRNA表达水平就显得很有意义。实验研究表明：定量结肠直肠癌淋巴结的癌抗原mRNA的表达量，可以作为诊断癌症微转移的重要依据。 为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以