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基因克隆的一般流程 基因的获得 PCR RT-PCR 载体 连接 准备感受态细胞 转化 重组子筛选 下游工作 载体的选择 基因工程载体一般要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。 有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 重组 DNA 技术的一般流程 目的DNA的获得 目的DNA与载体的连接 重组子导入受体细胞 重组子的筛选和鉴定 实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建 NGF 基因的克隆(T-A克隆) NGF-sense: a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt NGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg 5 6 pEGFP 荧光质粒表达载体 质粒DNA的酶切反应结果 质粒 M 酶切反应 M 酶切反应 pEGFP pT-NGF 酶切产物凝胶回收操作步骤（Gel Extraction Kit） 仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟，使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。备用。 重组子的筛选 耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性 蓝白斑筛选（互补现象） lacZ＋ plasmid 和 M15△ cell strain 不匹配粘端连接图示 连接反应的建立 连接反应的温度： 粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。 DNA量： 摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 ) 载体摩尔数 目标基因片段碱基数×载体重量 目标DNA摩尔数 目标基因片段重量×载体碱基数 载体和目标基因的连接反应 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进行连接。 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反应体系中： 加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10×Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。 重组子转入受体细胞 体外重组的DNA引入受体细胞 感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA 的状态 原理:（1）遗传物质的传递 （2）受体菌的选择与改造 重组质粒的酶切鉴定 重组子的鉴定 插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 DNA序列测定 荧光质粒转染观察