常规分子生物学操作要点讲解课件.pptVIP

基于同源序列的克隆技术 已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨基酸水平上表现出一定程度的相似性，在一些区段高度保守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是基于同源序列的候选基因法（homology-based candidate gene method）。 其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对基因组DNA进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这些序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆全长基因。 Sequence analysis of gene GsCBRLK —— By Ph.D. Liang Yang Sequence analysis of gene GsCBRLK —— By Ph.D. Liang Yang The hydrophilic residues were illustrated as circles, hydrophobic residues as diamonds, potentially negatively charged as triangles, and potentially positively charged as pentagons. Hydrophobicity is color coded with green (the most hydrophobic residue) and yellow (zero hydrophobicity) with the amount of green decreasing proportionally to the hydrophobicity. Hydrophilic residues are coded red with pure red being the most hydrophilic (uncharged) residue, and the amount of red decreases proportionally to the hydrophilicity. The potentially charged residues are coded light blue Fig. 2 A helical wheel projection prediction of CaMBD in protein GsCBRLK 目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。 在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，Urao等利用这一方法，根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的E-F手性结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码CDPK的2个cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK 2)，并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。 基因克隆的一种方法－RACE RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节 存在的问题及解决办法 RACE的基本概念 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。 3’RACE 和5’RACE 介绍一下不同公司生产的RACE试剂盒的特点 3’RACE原理示意图 mRNA (A)n 5’ GSP 3’ 5’ 3’CC…CC GSP2 GI … IG 5’ AAP AUAP nested GSP 3’ CC…CC 5’ GI … IG 5’ 3’ 3’ AUAP nested GSP 5’ 3’ 5’ (A)n 5’ 原理 电泳及迁移率 核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷 无反应活性的稳定的介质 降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。 分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨 范围为0.2～50kb之间. 不同浓度琼