细胞生物学试验课.PPT

细胞工程实验 课程组成员：杨慈清 、李虎、王红霞、许重洁 实验一 动物细胞的培养 一、实验目的 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。 了解化学消毒法的使用方法。 了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况及细胞增殖动力学测定的方法。 二、实验原理 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 三、实验方法 四、作业与思考 1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。 实验二 细胞融合技术与染色体提前凝集标本制备 一、实验目的 通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。 二、实验原理 M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。 三、实验方法 四、作业与思考 根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有什么启示? 简述细胞融合的原理。 PCC实验的主要意义是什么？ 实验三 小鼠MEF饲养层的制备 一、实验目的 1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。 2.巩固细胞培养相关的的技术。 二、实验原理 胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）的体外培养要求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于铺层，分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。 将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较高，而且生长状态也很好。在制备饲养层前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能的基础上失去增值能力，以免与ES的生长发生竞争。 在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度都会影响饲养层培养体系的质量。 胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下，且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态小，躯干部分不易分辩，操作困难。 细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容易纯化。 丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。 二、实验方法与步骤 1.MEF的获取： （1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF） 二、实验方法与步骤 2.接种并进行原代培养 （1）细胞计数，按照1*105个/ml接种于培养瓶中 （2）48小时换液，4-5天后传代 3.传代培养 （1）传3-5代，并长满瓶底部，并换液备用于第 二天处理 4.丝裂霉素C处理细胞 （1）用20mg/L和10 mg/L以及空白组的丝裂霉 素C处理2.5-3.5小时 （2）弃去含有丝裂霉素C培养液 二、实验方法与步骤 5.冲洗 （1）PBS冲洗3-6次，去除残余的丝裂霉素，加常 规培养液，在5天内用于步骤6 6.常规胰蛋白酶消化，重新接种，贴壁后即可以应用 （1）常规胰蛋白酶消化 （2）单细胞悬液以1*106个/ml接种于经过0.1%明 胶处理30min的培养瓶或者培养板中 （3）贴壁后即可以使用 四、注意