甲霜灵胶体金竞争法试纸.pptVIP

甲霜灵胶体金竞争法试纸条的研制 北京万华生物工程有限公司 2005.12.8 一、前言 农药甲霜灵简介 最高残留限量标准 检测方法的建立 分课题进展情况简单汇报 1.农药甲霜灵简介 农药甲霜灵（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米尔、瑞毒霉、甲霜安，化学名称D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，属酰苯胺类杀菌剂。 据中国农药毒性分级标准，属低毒杀菌剂。 对卵菌引起的病害具有独特的保护和治疗作用。 2.最大残留限量标准 联合国FAO/WHO食品法委员会（CCPR）《关于食品和饲料中农药最高残留限量的规定》中规定每日允许摄入量（ADI）为0.03mg/kg体重，禾谷类植物最高允许残留量为0.05×10-6 。 中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会于2005年1月25日发布，自2005年10月1日起实施中华人民共和国国家标准食品中农药最大残留限量标准（GB 2763-2005），该标准中规定了农药甲霜灵在食品中的最大允许残留量。 中华人民共和国国家标准甲霜灵在食品中最大残留限量标准 3.检测方法建立 甲霜灵不稳定，传统的气相色谱法检测困难。Krause在原有检测基础上进行改进，将高效液相色谱法（HPLC）应用于食物样本检测中，此方法普遍用于检测氨基甲酸酯类杀虫剂。虽然HPLC法具有更高的灵敏度，可以精确地对样品中的农药进行定性和定量分析，但此法要求精密复杂的仪器，而且需要专业人员操作，不适合于大批量样品的检测。 胶体金免疫层析诊断技术是在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的统一；同时具有保存方便，有效期长等特点。 与气相色谱法补充使用，具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点。 主要技术路线 4.分课题情况简单汇报 拟解决的关键技术： 小分子免疫原的合成、与小分子免疫原抗原决定簇配对单克隆抗体的制备及胶体金研究。 课题完成情况及效果 ： 本课题已成功研制出合成免疫原N2B，进行免疫获得单克隆抗体N2B1 4E6C10,这一针对甲霜灵抗原决定簇配对的单克隆抗体，亲和力好，效价达到10-9，并成功制成甲霜灵胶体金检测试纸，应用竞争法胶体金检测试纸最低检出量可达0.3mg/kg，达到国标要求。通过比对试验的验证，相关系数r=0.99996，说明方法的可靠性。因此，可以肯定胶体金免疫法在农药、兽药残留限量快速检测技术中，是最有效、最快速、最简便的方法。其优点在于灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、常温储存等，是适合于现场检测的一种快速检测方法，是食品安全检测的一种手段，互补现有检测方法各自的优缺点。 二、试验研究内容 免疫原合成 抗体制备 胶体金研究 半成品研制及鉴定 成品研制 1.免疫原合成 半抗原合成 免疫原合成 免疫原的鉴定 小结 （1）半抗原合成 将1.6g NaOH溶于200mL蒸馏水中，并加入10.056g甲霜灵，油浴50℃下搅拌6h，用TLC检测，反应完全；用乙酸乙酯洗涤反应液，弃去酯相；水层用浓盐酸调pH值至1.0左右，析出白色物质；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用无水硫酸钠干燥过夜；抽滤酯相，旋转蒸除溶剂，得到白色固体物质；用正己烷和乙酸乙酯重结晶，抽滤后得到半抗原N2（甲霜灵酸） 。 （2）免疫原合成 称取0.265g甲霜灵酸，用8mL DMF溶解，加入0.258 g DCC和0.125g NHS；用TLC监测反应完全程度，待反应完全后，抽滤反应液，用DMF洗涤两遍；称取2g BSA，用200mL 0.2mol/L pH值8.7的硼酸盐缓冲液溶解；将DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室温搅拌过夜，得到甲霜灵免疫原N2B。 先用蒸馏水透析2天，再用生理盐水透析3天，每天换液2次；透析后的溶液于3000r/min离心15min，取上清液于-20℃下冷冻干燥，冻干后分装保存。 同法可将甲霜灵酸连接到鸡卵清蛋白OVA上，合成检测原（N2 A）。 （3）免疫原的鉴定 紫外扫描 琼脂糖双扩散法鉴定 （4）小结 本试验通过化学合成法进行甲霜灵免疫原的制备，利用甲霜灵酸结构中的羧基，在适当的偶联剂作用下将其连接到载体蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通过紫外检测法、动物免疫试验对甲霜灵免疫原进行鉴定，证实免疫原合成成功。 2.抗体制备 单克隆抗体制备 多克隆抗体制备 （1）单克隆抗体制备 单克隆抗体制备流程 单克隆抗体特性鉴定 小结 单克隆抗体制备流程 用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在无菌条件下取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA