拟南芥抗日本曲霉毒素SAF突变体的筛选.docVIP

拟南芥抗日本曲霉毒素SAF突变体的筛选 　　摘要：黑麦酮酸Ｆ是从日本曲霉中分离的化感物质。以拟南芥为材料， 在萌发期和幼苗期分别以０．２50、０．３00 ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ为选择浓度， 根据种子是否萌发和幼苗能否存活为指标，并结合细胞死亡、ＭＤＡ含量、Ｈ２Ｏ２含量等植物生理生化指标初步筛选得到拟南芥抗ＳＡＦ突变体Ｈｓｔ １，为进一步研究ＳＡＦ的化感作用机理提供试验材料，也为拟南芥突变体的快速筛选技术提供参考依据。 　　关键词：拟南芥； 黑麦酮酸Ｆ； 突变体 　　中图分类号：Ｓ３３５；Ｑ９４９．７４８．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11407－1480-04 　　 　　Screening of Arabidopsis thaliana Resistant Mutants against Aspergillus japonicus Toxin SAF Using Physiological and Biochemical Methods 　　 　　ＬＩ Ｍｉｎｇ１，ＺＥＮＧ Ｒｅｎ－ｓｅｎ２，ＬＵＯ Ｓｈｉ－ｍｉｎｇ２ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｃａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｆ waｓ ａｎ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ０．２5 ｍmol/L ａｎｄ ０．３ ｍmol/L ＳＡＦ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｔ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ， ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ， ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ，Ｈ２Ｏ２ ｃｏｎｔｅｎｔ， Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ Hｓｔ １ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＳＡＦ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ． Ｔｈｉｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｗould ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ ｏｆ ＳＡＦ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Aｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ； ｓｅｃａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｆ； ｍｕｔａｎｔ 　　 　　黑麦酮酸Ｆ是从日本曲霉中提取的毒素［１］，研究表明，ＳＡＦ对多种植物具有显著的化感作用［２］，是一种寄主非选择性毒素，对于这类毒素化感作用的机制研究具有一定的普遍意义。为了深入研究ＳＡＦ对受体植物的作用机理，我们进行了拟南芥ＳＡＦ耐性突变体的筛选试验。目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，在植物研究的突破性进展中扮演着重要的角色［３］，而利用拟南芥突变体进行植物化感方面的研究还少见报道。此项研究将为进一步揭示ＳＡＦ对植物的化感作用机制，以及探索研究植物化感作用的新思路提供依据。 　　１材料与方法 　　１．１试验材料 　　１．１．１拟南芥生态型Ｃｏｌ种子萌发期筛选用滤纸，每皿放两张；苗期筛选播种于装有１／２ Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液蛭石的塑料小杯中，上面覆盖塑料薄膜并扎小孔。播种后于暗处以４低温处理４８ ｈ，将培养杯置于ＦＭ－５ＸＸ智能型人工气候箱中，生长条件为２2、１２０ μｍｏｌ／、１６ ｈ／８ ｈ，湿度为８０％。４ ｄ后全部出苗，揭去塑料膜，及时补充水分或营养液。 　　１．１．２ＳＡＦ毒素来源于华南农业大学热带亚热带植物生态研究所。 　　１．２试验方法 　　１．２．１筛选试验一般来说，筛选突变体均以在一定的筛选条件下，突变体植株与正常型植株在某一性状上呈现明显差异时，确定其为已突变的突变体［４］。参照我们前期工作的方法［２］处理拟南芥，观察植株对ＳＡＦ敏感程度不同而表现出的表型差异确定。测定其根、植株生长情况、黄叶率、存活率等生理生化指标。 　　１．２．２Ｈ２Ｏ２含量的测定取拟南芥幼苗叶片０．５ ｇ，加入预冷的３％的三氯乙酸研磨，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取上清液１ ｍＬ，加入等体积的１０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液和２ ｍＬ １ ｍｏｌ／Ｌ的ＫＩ，摇匀，３９０ｎｍ测吸光值，