报告1：Solexa测序原理、实验流程课件.pptVIP

Solexa测序原理、实验流程以及现在常用的微生物群落功能基因检测的方法 第一部分 Solexa测序原理、实验流程 Solexa简介 Illmina 公司包含有HiSeq 和MiSeq 测序平台，基于Solexa 技术，其基本原理是单分子簇边合成边测序(Sequencing by Synthesis，SBS)和dNTP 可逆终止化学反应。 Solexa测序技术利用单分子阵列实现在小型芯片（Flow cell）上进行桥式PCR反应。测序时加入的dNTP带有特殊的荧光基团，通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息，最终达到测序的目的。 Solexa测序的基本原理和流程 1、Prepare genomic DNA sample 利用物理方法将待测样品DNA随机打断成 100-200bp的片段，在打断后的DNA片段的两 端加上接头，解开双链。 2、Attach DNA to surface Solexa在测序时利用微注射系统将已经加过 接头的单链待测片段随机结合到Flow Cell的内表 面，每一个Flow Cell又被分成８条Lane，每条 Lane的内表面上能通过共价键的形式随机固定单 链接头序列和带接头的单链待测DNA片段。 3、Bridge amplification 在Flow cell内加入未标记的dNTP和酶，起始 固相桥扩增。 4、Fragments become double-stranded 所有的单链桥型待测片段通过酶的作用，被 扩增成双链桥片段。 5、Denature the double-satanded molecules 通过变性，释放出互补的单链，固定到附近 的固相表面。 6、Complete amplification 通过不断的循环，就会在Flow cell 的固相 表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。 7、Determine first base 加入DNA聚合酶、被荧光标记的dNTP和 接头引物，开始第一轮测序。 8、Image first base 利用激光激发之后，每一簇DNA发出的荧光就 会被捕获，然后确定碱基。 在每一个测序列簇延伸 互补链时，每加入一个 被荧光标记的dNTP，就 能释放出相应的荧光，测 序仪通过捕获荧光信号， 并通过计算机软件将光信 号转化为测序峰，从而获 得待测片段的序列信息。 该测序方法的主要优点： 通量高，Hiseq2000平台能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。 准确率高，边合成边测序的方法，可以减少由于二级结构所造成的片段缺失，该测序平台的错误率一般在0.26%-0.80%，尤其是在连续碱基测序的准确率很高。 该测序方法的主要缺点： 测序长度短，随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。 Solexa平台的应用 Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（de novo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。