罗氏沼虾仔虾病原菌的分离鉴定及耐药性试验.docVIP

罗氏沼虾仔虾病原菌的分离鉴定及耐药性试验 　　摘要：从病罗氏沼虾仔虾的匀浆液中分离到了一株大量生长的优势菌，感染试验表明分离菌对罗氏沼虾仔虾有较强的致病作用。对分离菌进行了形态、培养、生化和理化等表观生物学特性检验，同时对该菌进行了分子生物学鉴定，扩增了该菌的ｇｙｒＢ基因和１６Ｓ ｒＲＮＡ基因并进行测序和序列同源性分析。综合分离菌的表型特征、理化特性及分子生物学鉴定结果，判定病原菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌。采用纸片扩散法测试了分离株对４４种抗菌类药物的敏感性，结果表明，供试菌均对所测定的４４种抗菌类药物中的氨曲南等２４种药物敏感，对青霉素Ｇ等８种药物耐药。 　　关键词：罗氏沼虾；嗜水气单胞菌；药敏试验；ｇｙｒＢ基因；１６Ｓ ｒＲＮＡ 　　中图分类号：Ｓ９４５．４＋１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1008-04 　　 　　Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ 　　Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ 　　 　　ＦＡＮ Ｘｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｘｉａｏ－ｘｉａｏ，ＬＩ Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ，ＸＵ Ｍｅｎｇ，ＬＩＡＮＧ Ｌｉ－ｇｕｏ， ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ； ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ as Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｈｅｎｏｔｅｐｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ２４ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ ， ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ８ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｄｉｓｃ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ； Ａｅｒｏｍｏｎａｓ hydrophila； susceptibility testing； gene gyrB； 16S rRNA 　　 　　罗氏沼虾属节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属［１］，亦称白脚虾、马来西亚大虾、金钱虾、万氏对虾等，素有淡水虾王之称。原产地集中在厄瓜多尔沿岸，是目前世界上养殖量最高的三大虾种之一。由于其生长迅速、肉味鲜美、养殖周期短，且饲料成本低等特点，深受人们的青睐，在国内外市场上一直是十分畅销的水产品之一。我国于１９７６年从日本引进罗氏沼虾，现在养殖区已遍布广东、江苏、广西、上海等２０多个省、市、自治区，成为我国名特优水产养殖的主要品种之一［２］。近年来，随着工厂化养殖规模的逐渐扩增，养殖环境不断恶化等众多因素导致罗氏沼虾养殖过程中出现了较多疾病，特别是细菌性疾病，发病率、死亡率均较高，给广大的养殖户造成了很大的经济损失。２０１０年３月间，江苏高邮地区养殖罗氏沼虾仔虾大面积死亡，病仔虾主要表现为红体、行动缓慢、不摄食。本研究对分离自发病仔虾的细菌，采用常规表型特征、生理生化特性测定及１６Ｓ ｒＲＮＡ及ｇｙｒＢ基因序列同源性分析等分子生物学方法进行了综合鉴定，同时对病原菌进行了耐药性试验，旨在为该菌的有效检验和病害防治提供一定的参考。 　　１材料与方法 　　１．１病虾来源及细菌分离培养 　　发病仔虾取自江苏高邮地区一罗氏沼虾养殖池，病仔虾用生理盐水清洗后做匀浆处理，无菌操作条件下取匀浆液划线接种于普通营养琼脂培养基，于２８培养箱中过夜培养，次日进行观察，选取优势生长的菌落做纯培养，并将纯培养物转接于斜面培