分子生物学技术-分子克隆PPT.ppt

研究生科研基本训练 ——常用实验基本技术;生物医学研究常用基本技术;分子克隆技术; 1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。 ①目的基因的来源： 直接分离 适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。(适合原核) 人工合成 序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较短的）。;由mRNA逆转录合成cDNA 细胞总RNA分离 mRNA分离 目的基因mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆 从基因组文库中筛选目的基因 首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。 ;载体;2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。 3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。 4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。 5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。;RNA的提取和cDNA合成 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 质粒、PCR产物的酶切 重组DNA的连接 重组质粒的转化及筛选 凝胶电泳 测序技术 ;总RNA制备;Trizol法提取总RNA步骤;Tips：;避免RNA酶污染;DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 实验用品用0.1%DEPC水处理（2 h），高压蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无RNA酶实验用品。 操作过程中带手套、口罩。 ;逆转录反应（cDNA合成）;逆转录反应体系的基本成分;Tips：;PCR技术;三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对 (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达数百倍。;;PCR反应体系的基本成分;模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好). 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.;引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 ;引物设计原则 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。 引物中G+C含量通常为40%-60% 四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 在引物内, 尤其在3端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基 ;引物的选择与设计;Taq DNA聚合酶：Taq polymerase Thermus aquaticus 5‘→3’ DNA 聚合酶活性以及 5‘→3’ 核酸外切酶活性 无 3→5核酸外切酶活性 致命弱点：出错率高 LA Taq polymerase, PrimeStar DNA polymerase, Pfu DNA polymerase，Fast Pfu DNA polymerase dNTP ：dATP dUTP dCTP dGTP 一般反应中每种dNTP的终浓度为200~250