电泳技术().ppt

思考题: 比较以下几种分子量测定方法的优缺点：高效凝胶过滤，SDS还原电泳，SDS非还原电泳，ESI-MS,渗透压、超离心. 第四节 等电聚焦技术 4.1 Isoelectric focusing(IEF): 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行分离分析的一项技术。 1966年瑞典科学家Rilbe和他的学生Versterberg建立. 是目前分辨率较高的一种电泳技术(0.001pH) 适用样品为：蛋白质和其他两性分子 4.2 等电聚焦电泳的分类 A.根据形成pH梯度的原理不同分类： 人工pH梯度,载体两性电解质pH梯度，固相pH梯度 B.根据支持介质分类: 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。 C.根据电泳方式分类： 垂直管式，毛细管式，水平板式，超薄水平板式。 4.3 常规PAGE与IEF的区别（原理） 4.4 等电聚焦的聚焦效应 4.5 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 定义: 载体两性电解质是指一系列脂肪族多氨基多羧基的混合物。 pI的分布在2.5-11.0之间,比较精密的等电点分布在3-4之间。 载体两性电解质的特性： 分子量小：Ampholine的分子量约为700，很少一部分1000 可溶性好 缓冲能力强 导电性均匀 紫外吸收低 容易从聚焦的蛋白中除去 无毒、无生物学效应 pH梯度形成过程 制备方法： 配制丙烯酰胺溶液，把载体两性电解质 溶液加入其中，不加缓冲溶液。 4.6 固相pH梯度： 具有弱酸和弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定的不随环境条件变化的pH梯度。 制备方法： 梯度混合仪 CH2=CH-CO-NH-R 4.7 载体两性电解质pH梯度与固相pH梯度的区别 前者是两性电解质，后者是弱酸和弱碱。 前者制备简单，后者复杂。 后者分辨率高于前者。 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 4.8 测定蛋白质等电点的方法有三种： 标准蛋白法 微电极法 切胶法 三种方法的比较： [目的要求] 掌握电泳迁移率的概念 了解纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳的原理和方法 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法和在生化药分中的应用 掌握等电聚焦的原理、种类及各自的特点 掌握双向电泳的概念及应用 掌握毛细管电泳的原理和在生化分析中的应用 思考题： 试述以下三种电泳技术的原理: PAGE,SDS,IEF。 3．凝胶浓度和交联度与孔径的关系 凝胶浓度（T）： 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的总百分浓度。 交联度（C）： 亚甲基双丙烯酰胺（b),丙烯酰胺(a)。 有效孔径取决于凝胶总浓度T%，有效孔径随T%的增加而减小。 有效孔径决定蛋白质的分离 有效孔径与交联度(C%)有关。随交联度的增加而减小。 分离不同分子量样品所应选择的凝胶浓度 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 104 20-30 (1-4)×104 15-20 4×104-1×105 10-15 (1-5)×105 5-10 5×105 2-5 三、电泳后的检测 氨基黑10B法： 是一种酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。氨基黑染料染SDS-蛋白质效不好。染不同蛋白时，色度不等，色调不一（蓝、黑、棕），纯度扫描时误差太大。  考马斯亮蓝R250：灵敏度是氨基黑10B的5倍，但不适用于酸溶蛋白、醇溶蛋白。考马斯亮蓝G250：灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液，本低无色。 ANS法：1-苯胺基-8-萘磺酸， 本身无荧光，与蛋白结合后产生荧光，电泳后，取胶置平皿中，用此染料溶液浸1-3分钟，在紫外灯下观察，黄色。检测限100微克，如果不明显，将胶取出暴露空气中或浸在3摩尔盐酸溶液中2分钟，使蛋白表面稍变性，然后染色，检测线提高到20微克。染色后酶和抗体能保持活力。可用来测定酶活或者作抗原注射动物。 银染法： 机制：蛋白质上的各种基团（如琉基、碳基等）能与银离子结合，然后再将银离子还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。 蛋白质的染色程度与蛋白质上的特