胶体金和正向间接血凝检测技术王洪利.PPTVIP

猪瘟抗体检测技术 动物传染病教研室 王洪利 一、猪瘟概述 猪瘟（Classical Swine Fever，CSF；Hog Cholera，HC）又名猪霍乱、烂肠瘟，是一种高度接触性传染病，遍及全世界，是目前危胁养猪业重要的疫病之一。世界动物卫生组织（OIE）将此病死为A类动物疫病之一，我国将此病列为一类动物疫病。 猪瘟能引起猪的大批死亡、母猪的繁殖障碍、继发感染等，危害级大。国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）将此病列为优先防治的5个动物疫病之一。 （FMD、CSF、HP-PRRS、ND、HPAI） 二、猪瘟抗体检测的意义 1. 确定是否需要免疫 Ab ≥24 可以获得保护 Ab 24 不能获得保护 2. 确定免疫效果：（时间、疫苗、剂量、免疫抑制病） 3. 用于猪瘟的临床诊断 4. 非免疫无规定疫病（猪瘟）的确认 三、检测样本的制备 （一）血清的制备： 1. 采血：1-2ml（约0.5ml血清） 2. 凝固析出血清，不能出现溶血情况 3. 补体的灭活：检测前，56 oC水浴，灭活30min 前腔静脉采血：适合所有年龄的猪。 耳静脉采血： 用手压迫耳根静脉血管或用橡皮带绕耳基部环扎，使耳静脉怒张，适合大猪。 （二）猪唾液的提取 利用猪的唾液检测抗原或抗体，是一种较有发展前景的检测方法。 1.唾液的提取： 用一灭菌纱布悬挂于猪舍，猪会好奇咀嚼， 纱布吸取猪的唾液。 2.将纱布中的唾液挤出至灭菌烧杯或离心管中 3.离心：10000转/分钟，离心1分钟，取上清液 4.进行抗原检测或抗体检测 注意： 唾液抗体与血清抗体不是一个概念。引入相对抗体概念 相对抗体指用同一种方法检测出血清抗体和唾液抗体量的相对大小（用%表示）。 相对抗体的修正参数是建立在大量检测数据基础上的，这些必须包括完全阴性值、低抗体滴度值、中抗体滴度值、高抗体滴度值 四、猪瘟抗体检测的方法 1. 正向间接凝集试验 2. 猪瘟抗体检测试纸卡（胶体金技术） 3. 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 五、优缺点 方法一：猪瘟正向间接凝集试验 猪瘟正向间接凝集试验 （一）试验原理 （二）适用范围 （三）试验器材 （四）试验方法 （五）结果判定 （六）注意事项 （一）试验原理 用已知的抗原检测未知血清抗体试验，称为正向间接凝集试验（IHA）。 猪瘟抗原与对应的抗体相遇，在一定的条件下会形成抗原抗体复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。 若将抗原吸附（致敏）在经过处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原抗体的反应灵敏性，这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。 （二）适用范围 主要用于检测猪瘟血清抗体效价 （三）试验器材 1．96孔110oV型血凝板，与血凝板大小相同的玻板 2．微量移液器（50ul、25ul）、取液吸头 3．微量振荡器 4．猪瘟血凝抗原 5．猪瘟阴性对照血清 6．猪瘟阳性对照血清 7．稀释液 8．待检血清（每头猪采血0.5-1ml即可） 释出血清后56 oC水浴灭活30min，灭活其中的补体 （四）试验方法 1．加稀释液 在血凝板上1-6排的1-9（12）孔；第七排的1-3孔和5-6孔；第8排的1-12孔各加稀释液50ul。 2．稀释待检血清 取1号待检血清50ul加入第1排第1孔，吹打1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔移出50ul移入第二孔，混匀后取出50ul移入第2孔，混匀后取出50ul移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50ul丢弃。 依次稀释2号、3号…. 注意！每取一份血清时，必须更换吸头。 3．稀释阴性对照血清 在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50ul，倍比稀释至第3孔，混匀后从该孔取50ul丢弃。 第5-6孔为稀释液对照。 4．稀释阳性对照血清 在血凝板第8排第1孔加阳性血清50ul，倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50ul丢弃。 5．加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔各加血凝抗原（充分混匀，瓶底应无血球沉淀）25ul。 6．混匀、孵育 将血凝板置于微量振荡器上振荡1-2min。如无振荡器，用手轻轻摇匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红细胞是否混匀，不出现血球沉淀为合格。 盖上玻板，室温下静置1.5-2h判定结果，也可延迟到翌日判定。 （五）结