ELISA检测注意事项.pptVIP

酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术，是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP） ELISA检测抗体 Ag + Ab1 ? Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ? Ag-Ab1-Ab2* 竞争ELISA检测抗体 试剂的平衡 在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。 这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求 加样及试剂 加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的下1/3处，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，否则会导致加样不均匀或污染； 加样保持匀速 ：太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染； 每次加样应更换吸头，做到一人一吸头，以免发生交叉污染 样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。 如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样 加样及试剂 温度和时间 温育温度：ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度为37℃。 温育时间：孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长。 边缘效应的排除：即外周孔显色较中心孔深。研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种是放在水浴箱的隔板上，使板条与水直接接触，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3 处，不可将板条叠加放置。排除边缘效应可以提高实验的稳定性。 边缘效应 洗 涤 ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。 最好要求使用洗板机：减少操作者人为误差、保护操作者、降低板孔残液量。 以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。 洗 涤 但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。 洗 涤 显 色 一般商品试剂盒显色反应条件为37℃。从理论上说，37℃ 25~30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。但为使弱阳性样本孔能有充分的显色，应在37℃下反应30分钟后终止反应。 一般底物经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色 此外，在加入底物前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或EP管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。 显色 比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行 显色反应终止后应在30分钟内完成比色 双波长比色：校正波长均用630nm。在敏感波长（450nm）和非敏感波长（630nm）下各测定一次。建议尽量使用双波长比色调零而不用空白对照调零. 读数 使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用吸水纸擦干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。 ELISA实验的影响因素 标本的采集和保存 一般使用血清（浆）。 标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰结果，可造成假阳性； 长菌的标本会因细菌分泌一些酶，干扰酶联反应； 抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成