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液相色谱基础知识 色谱原理 色谱原理 色谱原理--分离过程 色谱参数 --保留值 液相色谱分析基本概念 液相色谱(LC or HPLC)——以液相为流动相的色谱，或流动相为液体的色谱。 液液色谱——以一种液体作流动相，另一种液体作固定相的色谱。 液固色谱——以液体作流动相，以固体作固定相的色谱。（俄国植物学家） 液相色谱分析基本概念 柱色谱——把固定相装在一根管子里（色谱柱），液体流动相流过色谱柱中的固定相。 液相色谱分析基本概念 平面色谱——纸色谱和薄层色谱(TLC:Thin Layer Chromatography)。用滤纸或是涂在玻璃板（或铝箔）上的硅胶（或三氧化二铝等）作固定相，利用滤纸或硅胶层的毛细管作用把流动相（溶剂或叫展开剂）从底端吸上来，使混合物得到分离。 液相色谱分析基本概念 凝胶渗透色谱（GPC：Gel Permeation Chromatography）——是液相色谱的一个分支，以一定尺寸的多孔固体（凝胶）作固定相，以液体作流动相，按样品分子尺寸大小进行分离的方法。（类似于气相色谱的分子筛填充柱）主要用于测定样品中物质的分子量及分子量分布。（环境水样也如此，目前很多研究与此相关——消毒副产物、催化氧化、膜处理）。 液相色谱分析基本概念 超临界流体色谱（SFC：Supercritical Fluid Chromatography）——以超临界状态流体作流动相，以固体或液体作固定相的色谱。超临界状态流体是指温度和压力都在超临界温度和超临界压力之上时，物质状态处于气体和液体之间，既不是气体也不是液体的一种特定形态的流体。超临界流体色谱类似于液相色谱，超临界流体由于其密度不同具有特殊的溶解各种物质的能力。 液相色谱分析基本概念 我们常用的液相色谱是指液固柱色谱。 液相色谱仪的基本组成 液相色谱—流动相 单一溶剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃、MTBE等或水。 混合溶剂：2种以上混合溶剂，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸缓冲溶液、己烷-乙酸乙酯等。 等强度洗脱：流动相组成和流量保持恒定。 液相色谱—流动相 梯度洗脱：流动相组成比列和流量随时间变化。需要比例阀、阀驱动器、溶剂比例控制器、梯度程序器。 注意：1、溶剂需要带盖密封；2、溶剂需要脱气处理：搅拌下真空抽气或通入惰性气体（氦、氮）驱走其中的溶解气体。 液相色谱—高压泵 有往复泵、注射泵、气体放大泵等，不锈钢材质，主要是要能克服大阻力以恒定流速输送流动相。 Pump Pump 液相色谱—进样阀 进样阀是保证色谱分析准确度的重要部件。 六通手动进样阀：罗达因（Rheodyne）进样阀：两个位置，一是取样，二是进样。有固定体积的进样定量环管，0.5-100ul之间，可根据样品情况更换选用。 Injection port 液相色谱—进样阀 自动进样器：模拟手动进样过程。 注意：1、进样阀内部通道很细，不能带有固体颗粒，所以水样需要用滤膜过滤(0.45um or 0.2um)；2、样品浓度不能太高，以免在进样阀内析出结晶；3、经常清洗进样阀通道。 Auto sampler 液相色谱—自动进样样品架 液相色谱—色谱柱 不锈钢材质、有柱管、接头和过滤片，柱管内填充几微米的小颗粒填料即固定相（当前仍以硅胶基质的填料占主导地位）。通常4-8mm、也有1-2mm的细管径分析柱，还有1mm以下的毛细管分析柱。 液相色谱—色谱柱 液相色谱—色谱柱 色谱柱填料的不断进步是液相色谱能不断解决成千上万分析难题的关键。 液相色谱—检测器 通用型检测器：视差折光检测器 。 选择性检测器：紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器等。 紫外吸收检测器：样品有紫外吸收、样品分子种有生色基团、有机物有羰基、芳香基、烯基等 。 液相色谱—紫外可见检测器 单波长紫外吸收检测器：单色光光源（低压汞灯254nm）——样品——检测器（光电二极管）。 UV/Vis --Fixed Wavelength Detector 液相色谱—紫外可见检测器 可变波长紫外吸收检测器：复合光光源（氘灯190-600nm）——单色器（光栅）——样品——检测器（光电二极管）。 UV/Vis --variable wavelength detector 液相色谱—紫外可见检测器 二极管阵列检测器：复合光（氘灯或卤钨灯190-800nm）——样品——单色器——阵列的检测器（光电二极管）。 UV/Vis --PhotoDiode Array Detector 液相色谱—紫外检测器 液相色谱—紫外检测器 液相色谱—荧光检测器 荧光检测器：样品中物质分子能在特定波长的光激发后跃迁到高能级状态，在返回到基态的过程中，会发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率 液相色谱—荧