GST融合蛋白表达与纯化.docx

一、蛋白质纯化流程图图1 可溶性重组蛋白的纯化图解，这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜组分内，或在大多数情况下在细胞质内。第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提取物，之后可以进行常规的纯化步骤，或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。图2 在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。必须将细胞破碎开，然后通过差异离心分离不可溶的包含体，使用变性溶剂来溶解，当除去变性剂后，溶解的蛋白质发生复性，还需要进一步的精制步骤来除去少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。图3 存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎，以释放出蛋白质，通常每克细胞加入2-10ml适当的缓冲液，在除去不溶性材料后，处理通常需要几步，按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度蛋白质，可能会需要最后的精致步骤，以除去最终的微量污染物。图4 与膜相关的和溶解性差的蛋白质（非重组的）的纯化图解。通过分离含有目的蛋白的细胞器，可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋白，尽管松散解离的蛋白质也可以在高pH、含EDTA（或使用少量的有机溶剂，如正丁醇）的条件下不用去污剂来提取，如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋白质的完整性，则需要对常规的分级分离方法进行一些修改。二、大肠杆菌表达系统的选择基本方案一 在pL启动子控制下的表达：温度诱导与含有pL启动子载体一起使用的大肠杆菌宿主菌必须含有一种由cI857编码的温度敏感的阻遏蛋白，或作为休眠噬菌体整合到宿主的染色体中，或构建在携带外源基因的同一质粒中。在高温下，cI857基因的表达被灭活，呈现阻遏作用，使pL启动子下游的基因转录。细胞首先在30℃生长至理想的密度，然后将温度升至42℃，便可诱导蛋白质的合成，合适的抗生素是由表达载体决定的。材料 （带√的项见附录1）含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株（如Coli B、W3110）√LB培养基√1000x抗生素贮液20ml无菌培养管42℃水浴摇床150ml摇瓶，无菌1、制备少量大肠杆菌宿主菌株的液体培养物，该大肠杆菌是由处于稳定期的含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的。方法是：从新鲜的LB琼脂平板上挑单菌落，接种于含2ml LB培养基（补加适当的抗生素贮液）的20ml管中，将培养管在30℃旋转摇床中200rpm温浴过夜，不要超过30℃。2、用PBS将一小份菌液稀释10倍，用水作空白对照，测OD600值，以证实培养物已达到稳定期（在1cm光径的比色杯中，OD值为1-2；OD值为1时，相当于0.5x109-1x109个/ml）。3、将一个含有50ml LB培养基（含适当抗生素）的150ml摇瓶放入42℃水浴摇床中，预热培养基。要确保温度准确（过低的温度将导致阻遏物的灭活不完全，诱导不佳），注意某些宿主菌（如大肠杆菌HB101）不能耐受42℃，在此温度下生长明显降低。4、将2ml过夜培养物转移至含有预热培养基的瓶中，取1ml样品，按第5步所述的方法进行处理。将50ml培养物放回42℃水浴摇床中，在剧烈振荡（200rpm）下温浴3h。在温浴的最后，取另外1ml样品。在接种和取样品时，操作要快，以保持温度稳定。5、在室温条件下，用最大速度离心每种样品2min，弃去上清，进行SDS分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，在SDS前，沉淀物可于-20℃长期保存。6、用剩余的50ml培养物来分析质粒的稳定性、确定样品的可溶性（见辅助方案3）或制备周质提取物或细胞外培养基样品（见辅助方案4和5）以获得重组蛋白。如果要保存的话，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导细胞在最低营养培养基中生长至对数生长期，以获得色氨酸饥饿，用色氨酸类似物吲哚-3-丙烯酸灭活残余的trp阻遏物。材料（带√的项见附录1）用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株√M9最低营养培养基加0.5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）√1000x抗生素贮液√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）20ml无菌培养管150ml摇瓶37℃定轨摇床1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。2、用水作空白对照，测OD600。3、将过夜培养物移至含有50ml M9培养基/酪蛋白水解物（补加适量的抗生素）的150ml培养管内。4、取1ml起始样品，立即按第7步的方法进行处理或-20℃保存。5、在37℃定轨摇床中，剧烈振荡（200rpm）将培养物温浴1-2h，测OD600，以确保细胞进入完全对数生长期（OD6