[自然科学]生物大分子的电子显微镜技术.pptVIP

生物大分子的电子显微镜技术 关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类 研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能 研究生物大分子的方法 物理化学方法探讨理化特性 X－射线衍射技术分析结晶样品 电子显微镜的直接观察技术 核酸的电子显微镜研究技术 核酸的分类： 核小体－－DNA 与蛋白质聚合一起构成的染色体的单位 核酸分子电镜观察的要求: 核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链; 核酸分子太细需要加粗； 提高电子反差。 分子长度测量及计算 对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子的长度应相对一致。 观察100个以上的分子，拍像记录； 矫正电镜放大倍数； 测量分子，50~200份单分子； 统计学方法计算平均值，作出长度分布图； 用已知的标准分子进行对照测算 经验公式：ds 1um=2.07X106Da s s 1um=1.20X106Da 特点和应用 样品量少；操作简便；制备样品时间短。 适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量； 进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究； 基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。 蛋白质单分子展层操作 对核酸样品和试剂的要求： 1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份； 2.核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性; 3.样品浓度在5ug∕ml以上; 4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染; 5.溶液的PH在6~10之间; 6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯; 7.所用试剂为分析纯,器具洁净,无去污剂等残留; 8.制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤,使RNA酶失活. 染色与投影 染色----增加核酸分子的电子密度 样品展层后,粘取至铜网上,经过染色和金属投影以增强反差. 染色液为1~2%的PTA, (用90%乙醇配制,100ml染液中含1ml的浓硫酸)或醋酸双氧铀,染色10~30秒后.自然晾干. 投影-----使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度5~9o,用铂~钯合金进行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜,以增加强度. 染色与投影 染色----增加核酸分子的电子密度 样品展层后,粘取至铜网上,经过染色和金属投影以增强反差. 染色液为1~2%的PTA, (用90%乙醇配制,100ml染液中含1ml的浓硫酸)或醋酸双氧铀,染色10~30秒后.自然晾干. 投影-----使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度5~9o,用铂~钯合金进行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜,以增加强度. 电镜观察要求 染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至80~100A，故在10万倍以下可以观察到； 蛋白质单分子膜展层技术的原理 某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变性薄膜，单浓度和加到溶液表面的量合适，该膜就展开成为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。如果将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸碱性基团便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合，核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子随着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展为弯曲的二维结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持完整性，经捞网，染色，金属投影，电镜观察。 特点和应用 样品量少；操作简便；制备样品时间短。 适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量； 进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究； 基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。 蛋白质单分子展层操作 对核酸样品和试剂的要求： 1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份； 2.核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性; 3.样品浓度在5ug∕ml以上; 4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染; 5.溶液的PH在6~10之间; 6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯; 7.所用试剂为分析纯,器具洁净,无去污剂等残留; 8.制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤,使RNA酶失活. 样品配制 醋酸铵法: 上相液组成:醋酸铵 (终浓度)0.5~2Mol(PH7.5) 核酸样品 0.5~1ug∕ml 总体积50ul 细胞色素C 0.05~0.1mg