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五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 1)? DNA的纯度 2)? DNA的甲基化程度 3)? 酶切消化反应的温度 4)? DNA的分子结构 5)? 核酸内切限制酶的缓冲液 * 关于限制性内切酶的星活性 1 、 DNA的纯度 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。若污染了在DNA制剂中的某些物质后，（例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以及高浓度的盐离子等）都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。 为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本） ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA，因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。 然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后（内含Mg2+ ），DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA 。 2、 DNA的甲基化程度 限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈地影响酶的活性。 为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备的质粒DNA。 3、 酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。 不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、Bcl I是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上。 消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。 4、DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差异造成的（位点偏爱 见教材P42）。 ? 5、限制性核酸内切酶的反应缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括： ①氯化镁或醋酸镁，②氯化纳或醋酸钾 ③ Tris-HCl（-AC）, ④ ?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)，⑤牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子的，通常是Mg2+。购买时厂家会提供专门的缓冲液并有说明其成分。有些核酸内切酶可以在2种甚至4种缓冲液中均有较高的催化活性。 对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能最佳，一般为pH6—8。 6.星（＊）活性：在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象称为Star活性。 有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G ↓ AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星活性，以EcoRI*表示。 六. 限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，大多数限制性内切酶的钝化方法是65℃温浴5分钟。 但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对