绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用演示幻灯片.ppt

* * 绿色荧光蛋白(GFP )技术在细胞生物学研究中的应用 荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 检测简单， 结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白(Reporter protein) 。可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。 图1 绿色荧光蛋白 1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先从一种水母类动物Aequorea Victoria中分离纯化出了GFP, 1992年Prasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一级结构,1994年M.Chalfie[3]等最早用重组野生GFP型基因做报告基因, 成功地在原核和真核生物中得到表达。90年代后, 人们对GFP的性质和应用进行了不断深入的研究,有关GFP 及其利用的研究进展较快，现在它已经发展成了现代生物学研究的一个精确工具。目前在细胞生物学、植物学、动物学、微生物学等学科研究中都有着相当广泛的应用。随着人们对GFP发光机制研究的深入, 通过对其发光团区域和其它区域进行随机诱变, 已经得到了许多GFP突变型, 有的发蓝光或黄光而不是绿光[4]；有的发出的荧光比野生型的强很多, 激发后很容易用肉眼观察到；有的则是温度突变型, 其表达不受温度的限制[5]；有的突变体则可以特异地在某些物种中高效表达。这些突变体极大地拓宽了GFP的应用范围, 使GFP在细胞生物学和分子生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前景。 一、GFP的结构 图2 绿色荧光蛋白结构 GFP编码238个氨基酸的多肽单体，只有完整的GFP 分子才会产生生物荧光，被切断的GFP(即使是C、N 末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP 失去发光能力[6]。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团(Chromophore)的部位[7]。在GFP 的初级氨基酸序列上，第65～67 个氨基酸(Ser-Tyr-Gty) 形成环状三肽，以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定, 不易变性, 用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是当pH 值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP 的生色团之间是通过共价键结合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。[8] 二、GFP 的应用特点 1 易于检测 GFP荧光反应不需外加任何反应底物，酶或其它共反应因子, 也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发, 即可发出绿色荧光，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到。灵敏度高, 对于单细胞水平的表达也可识别, 同时还可利用其进行定量检测。由于GFP 对活细胞基本无毒害, 因此无须特殊处理就可以很方便地进行活体观察。而且，具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析诊断等研究。这就使GFP有可能成为一种快速、简便、经济的标记蛋白，GFP基因作为报道基因可能有广泛的用途。 2 荧光稳定 GFP无光漂白现象，在很大的pH 范围内(pH7～12)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小，只有在超过65℃时才会变性，荧光消失。荧光显微镜强光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强[9]。特别在450～490 nm蓝光波长下更稳定,但在340～390 nm或395～440 nm范围内，仍会发生光漂白现象。对于长时间光照，GFP也有很好的耐受性，根据Sheen 等的研究，GFP在受体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。 3 广谱性 首先表现在它的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次就是没有细胞种类和位置的限制，在各个部位都可以表达，发出荧光。 4 易于载体构建 由于GFP 较小，只含有238 个氨基酸，编码GFP 的