质粒DNA提取与鉴定.docVIP

质粒DNA的提取与鉴定 目的 学习和掌握用碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法，以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。 原理 质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄生性的自主复制子。 细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。 从大肠杆菌分离质粒的方法很多，碱变性抽提法是常用的方法之一，此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。 在抽提过程中，由于各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在： 共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在； 开环DNA（ocDNA），此种