[医学]分子生物学C11基因分析的基本策略.pptVIP

第十一章基因分析的基本策略 基因操作——所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术 基因分析 基因功能的研究 基因分析的构思 了解基因的组成——基因的DNA序列测定 了解基因在染色体的位置——原位杂交 了解基因在基因组上的拷贝数——Southern Blot 了解基因表达水平——Northern Blot、RT－real time PCR 了解基因表达产物的水平——Western Blot 第一节 利用DNA定性定量分析可从不同角度对基因和基因组进行研究 （一）DNA 序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化 两种DNA序列测定基本技术具有不同的原理和特点 双脱氧链末端终止法(diddeoxy chain termination)或Sanger 法 化学裂解法或（Maxam-Gil-bert 法） DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2，3--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5→3外切酶活性。 b． Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学) ??? 该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；被修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。? ??? 硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特异性切割。 d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) ?? 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。 当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的应用：① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变；② 可用于不同DNA片段之间的序列比较；③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；④ 可用于检验传统测序技术的准确性。 （二）揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义 揭示基因和基因组一级结构变化是推动医学研究纵深发展的关键 通过对基因组遗传语言的破译，揭示基因结构与功能的关系 比较基因组学就是在基因组一级结构的基础上，通过比较发现新基因或基因新功能的过程 (三) 通过DNA序列分析可以鉴定基 因和基因组的变异 基因和基因组变异是多种人类遗传性疾病的根本病因 如： 凝血因子VII的基因突变是血友病甲的发病原因 利用比较基因组学，比较不同生物基因组和基因序列 通过逐一阅读基因的DNA序列，可以准确地发现突变位点和突变碱基 （四）通过DNA序列测定分析人工重组的基因 二、Southern 杂交和PCR等技术可 分析基因拷贝数的变化 Southern blot PCR Real-time PCR 代表性寡核苷酸阵列分析 （一） Southern blot 可以检测基 因拷贝数的变化 Southern Blot 的基本过