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聚合酶链式反应（PCR） 简介 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR): 1983年美国Mullis等发明了PCR技术，可在几小时内将DNA片段扩增109倍，具有特异性、高效率、忠实性 第一节 PCR基本原理和影响因素 一、PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 图1：PCR扩增靶DNA示意图 双链靶DNA 例1：PCR反应步骤 二、PCR反应体系的组成及作用 组成PCR反应体系的元素主要包括： 模板核酸、引物、 TaqDNA聚合酶、 缓冲液、Mg2+、 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP)等 （一）模板（template) DNA或RNA cDNA 可来源于各种标本 临床标本，法医学标本 病理标本，考古标本等 （二）引物(primer) 引物是与待扩增核酸序列两端的已知序列互补的寡核苷酸片段 例：上游引物，下游引物 5’CTGATACGTACGAT………GCAGTTAGATGT3’ 3’……ATCTAC5’ 5’GATACG……3’ 3’GACTATGCATGCTA………CGTCAATCTACA5’ 引物设计原则 1.引物长度： 特异性一般通过引物长度和退火温度控制。寡核苷酸长度一般为16~30bp。引物长度增加，能提高特异性，但是在扩增退火时被引发的模板会减少，而降低反应效率。 引物设计原则 2.引物的3’末端和5’末端核苷酸 引物3’末端是PCR延伸的起始点，不能有错配，否则影响特异性。引物3’端尽量避免碱基A和作为密码子的第三个碱基。3’末端不能进行修饰。 引物设计原则 3.GC的合理含量： 引物设计原则 4.避免引物自身和引物之间的互补 一般单个引物自身连续互补碱基不能超过3bp，一对引物间也不宜多于4个连续碱基的互补，尤应避免3’端的互补。 四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同碱基存在。 引物设计原则 5.引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。 引物设计软件 Gene Runner 3.0 Oligo 4.0 引物分析软件 根据设计需要设置参数 对设计引物进行分析 酶切位点 引物二聚体 发夹结构 引物浓度 两条引物一般各在0.1~0.5μmol/L, 浓度太高会引起错配及非特异性产物扩增，增加形成引物二聚体的几率；太低则可能达不到扩增效果或产量太低。 引物合成的质量 引物一般经PAGE或HPLC纯化，以减少非特异扩增和信号强度 冻干引物可以常温下运输，-20oC可以保存12~24个月，甚至更长，液体状态于 -20oC可以保存6个月或更长 （三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶最初从嗜热水生菌中分离提取，现已有基因工程酶(如AmpliTaqTM) 分子量94KD，在70~75oC时具有最高活性 Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性 Taq DNA聚合酶具有5’ 3’聚合酶和 5’ 3’外切酶活性，缺乏3’ 5’外切酶活性，因而无校正阅读功能 错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响 Taq DNA聚合酶在反应体系中的终浓度常为2~2.5U/100μL。酶量过少合成产物量低，酶量过高则非特异性产物随之增加。 （四）缓冲液 用于PCR的标准缓冲液含： 50mmol/L KCl 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 1.5mmol/L MgCl 另加入保护Taq酶试剂: 牛血清白蛋白（100μg/ml） 或明胶(0.01%)或二硫苏糖醇(DTT)等 （五）Mg2+浓度 Taq酶