FACSCalibur仪器原理.PDF

第2 章 FACSCalibur 儀器原理 流式細胞技術是一個定量分析的技術。定量測量在細胞生物學中之所以重要，是因為 要想鑒別出一個細胞群體，主要是依據細胞特殊標記物的數量，而不僅是依據標記物的存 在與否。多參數相關分析可以對細胞固有的性質，例如光散射的測量與定量測定細胞的特 徵如表面受體、和DNA 同時進行。當然，必要時還可同時再測定胞漿內抗原、核內抗原等 等。這樣，就有可能從一個複雜的細胞混合體中，識別出某一個特定的細胞亞群。由於只 有對大量的細胞進行測量才能發現稀有的亞群並把它分選出來，所以快速測量是必需的。 這裡所謂分選即流式細胞分選術，是根據所測定的各種細胞性質的不同組合，從細胞群體 中將某個亞群分選出來，以對它進行功能研究、形態學研究、進一步培養或做其他的分 析。 本公司是生產流式細胞儀的主要廠家，我們生產出一系列桌上型和落地型的流式細胞 儀，並研發生產了 FCM 所用的各种單株抗體和螢光試劑。桌上型的儀器（FACScan, FACSort, FACSCalibur 等）易于操作，穩定性好，分析速度快，適合在臨床實驗室中應 用。落地型流式細胞儀 (如FACStar Plus, FACSVantage SE, FACSVantage Diva 等) 具有 快速分選功能，功能齊全，分析靈活，適合基礎科學與生物醫學研究。我們在此先介紹桌 上型細胞儀。 2.1 流式細胞儀的工作原理 流式細胞儀包括液流系統、光學系統、分選系統和電子系統。待測樣本中的細胞經液 流系統傳送依序地通過流式細胞儀中雷射照射的區域，細胞受雷射的激發產生信號，被信 號接收器接受並放大，這些放大了的信號經電腦分析處理，並以圖表的形式直觀地顯示出 來；通過分選系統還可以將某些類型的細胞群體篩選出來。流式細胞儀產生並分析的信號 主要有光散射信號和螢光信號。光散射信號的強弱可以反映細胞的大小、形態及胞漿顆粒 化的程度等。依螢光素的不同，用不同波長的光激發，發射出不同波長的螢光，可顯示不 同的顏色，在不同的實驗體系中，這些螢光信號就可以反映不同的細胞生物學特性。 2.1.1 分析原理 將待測細胞染色後製成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的 平衡緩衝液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘 液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排 列，依次通過雷射照射區 (液柱與入射的雷射束垂直相交點稱為檢測區) ，被螢光染色的細 胞受強烈的雷射照射後發出各色螢光，同時產生光散射。螢光信號的收集可在雷射光束垂 直的90 度方向放置光學系統（透鏡、光欄、和濾片等）用以收集螢光信號，投向檢測器。 螢光檢測器是光電倍增管，散射光檢測器是光電二極管，用來收集前向角散射光。 BD Biosciences, COE 2- 1 光散射信號在前向小角（2-10 度）進行深測，這種測量稱“前向角散射＂或“前方散 射＂。在這種情況下產生的光散射信號基本上反映了細胞體積的大小。細胞發出的螢光信 號和光散射信號同時被呈90 度角方向的螢光光電倍增管和前向光電二極管接收，被放大積 分後轉換為電子信號輸入多道（1024 道）脈衝高度分析儀，並在電腦螢幕上，以一維直方 圖、二維點陣圖、或三維圖形顯示出來。或將圖形和數據直接輸入聯機專用的電腦，或存 入磁碟以備分析。電腦快速而精確地將所測數據計算出來，結合多參數分析，從而實現了 細胞定量分析。 2.1.2 分選原理 新一代的桌上型細胞儀，如 FACSCalibur 細胞儀可加裝一分選系統，它的分選是應用「通 道選擇式」的設計原理（passageway selection, 如圖? ）。如設計圖中所示，水道可區分成三段: 細胞分析區、分析前區、與分析後區，在水道中 裝置一可動式捕捉管 (catcher tube) ，捕捉管開口 處可在「細胞分析區」與「分析後區」間快速切 換，開口處位於細胞分析區時，可抓取欲分選的 細胞，開口處位於分析後區則不分選。為了方便 操控，該捕捉管可被一串連的電訊調節器控制， 並適時地移動以捕捉有用的細胞，而拋棄不相干 的細胞雜質。這一類桌上型細胞儀可以亦可進行 螢光激發細胞分選 （Fluorescence Activated Cell Sorting ），將一特定族群細胞從複雜細 胞族群中分選出來