[院校资料]PCR原理.ppt

聚合酶链式反应（PCR）原理及引物设计 肿瘤分子生物学 开放实验室 2012-11-03 背景 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 逆转录PCR(RT-PCR) 先以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA； 然后以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增特定目的基因 通常用于检测特定基因mRNA在样本中的表达水平 PCR反应分为三步： 经典循环参数（500bp以内） PCR 反应五要素： RT-PCR注意事项 Total RNA质量：OD260/280 1.8-2.0之间，凝胶电泳条带28S：18S接近2：1，无5S或5S条带很弱 RT-PCR注意事项 应常规消化痕量的gDNA Total RNA 或mRNA反转录不宜过量，通常20ul体系为1μg Total RNA或mRNA PCR扩增产物片段不宜过长，80-300bp为宜 扩增循环数为25-28cycle为宜，不宜超过35cycle 实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR) 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 内参基因少为人知的秘密 α-Tubulin,β-actin, GAPDH等内参基因在不同的组织类型和疾病状态中表达水平并不恒定,尤其是α-Tubulin和β-actin。因此，在检测不同组织中的特定基因相对表达时，不宜采用α-Tubulin分子作为定量PCR的内参来计算，准确的做法是采用绝对定量法。 PCR常见问题分析 问题一：无扩增产物 PCR常见问题分析 PCR常见问题分析 PCR 引物设计 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构 引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时使用较长的引物，但最多不超过70个核苷酸。 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　 引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 引物的内部稳定性 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。 引物的保守性与特异性 通用引物保守性：检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增