重组dna技术与基因工程 - 副本.ppt

PCR克隆目的基因的基本程序 基于同源重组的In-Fusion克隆法 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 与载体5’端15个碱基相同的序列 目的基因序列 PCR扩增 In-Fusion酶介导同源重组 盒式PCR扩增法 适用于外侧序列未知的靶基因扩增 染色体DNA Sau3A部分酶切 连接，加装盒式接头片段 5 ’ 端不含磷酸基团 变性 引物退火 P1 P2 P1 退火 延伸 5 ’ 5 ’ 5 ’ 基因内引物扩增 5 ’ 5 ’ 5 ’ P2 5 ’ 5 ’ 5 ’ P1、P2为盒式引物 5 ’ 5 ’ 测序设计保守引物 基因组DNA切割并自连成环 反向PCR扩增法 TAGTSLVVRK NYWSSAEPHC 蛋白质 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 根据已知的氨基酸序列设计简并引物 简并引物介导RT-PCR 保守引物介导PCR 测序确定目标基因的两端序列 D 化学合成法 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 补钉延长法： 混合退火 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 或RCR扩增 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列 而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA 序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终 获得含有目的基因的目的重组子。由于大多数氨基酸拥有简并密码子 故在探针序列的设计时必须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列： Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列： TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列： TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计。 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩 从反应机理上来讲，DNA化学合成方式有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序较简 合、分离、去保护五大操作单元。 便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放