遗传病基因诊断-2015-2016学年PPT.ppt

基因诊断;主 要 内 容;一、基因诊断概念;二、基因诊断基本原理及常用技术;制备待测核酸样品;（1）斑点杂交（Dot blotting hybridization）;1975年Southern建立的检测DNA技术。 基因组DNA 限制酶消化 凝胶电泳分离 变性 转移到 硝酸纤维素膜(尼龙膜) 固定 预杂交 探针 杂交 洗膜 放射自显影 分析杂交片段的大小及密度。 可检测: ① DNA片段的缺失,插入,重排等。 ② 改变限制酶酶切位点的点突变。 ③ DNA扩增等拷贝数改变。 ④ RFLP等多态性。;检测RNA的分子杂交技术 提取组织总RNA oligodT mRNA 含甲醛的 琼脂糖凝胶电泳分离 转移 预杂交 探针 杂交 洗膜 放射自显影。 检测特异mRNA大小和表达量。;染色体标本上，组织切片上分子杂交 原位杂交----3H标记探针 FISH-----荧光素或生物素标记 应用于基因定位，染色体数目及结构异常诊断。 组织切片上的FISH----mRNA水平表达及一些病原体感染诊断。;?肌球蛋白mRNA在胚胎小鼠心脏原位表达;荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染;1985年美国cetus公司的Kary Mullis创建，80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔化学奖。 模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。 ;步骤：;PCR扩增;（1）PCR----RFLP;（2）PCR----SSCP; --------------------------- primer --------------------------- ↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓ 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 ;(3) PCR----DGGE;4、DNA测序;DNA自动测序;焦磷酸测序;焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变;下一代“克隆”测序;5、DNA微阵列（DNA芯片）;High-resolution melt curve analysis (HRM);Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization (CGH);三、基因诊断方法;检测点突变;（1）RFLP方法---检测已知突变;镰状细胞血红蛋白（HbS）; 56 bp 54 bp ;（2）ASO探针杂交法--检测已知点突变;2