酶联免疫吸附实验PPT.ppt

酶联免疫吸附实验;掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 了解其他免疫标记技术 ;二、实验原理; 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。;免疫标记技术 =; 免疫标记技术; 是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。 ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 ; ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ;ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。 由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。;常用酶及其底物;Colorimetric ELISA Substrates ;ELISA常用的几种方法?? ? (一)测定抗原的，主要有四种方法 1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。;;;;;(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. ;HBV感染后的血清学指标:;实验材料;微孔条已经包被HBsAb 1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加，轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果，读数在加终止液10分钟内完成。;结果判定： 1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1。 2、阴性对照孔OD (optical density)均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ CO≥1者为阳性， 样品OD值S/ CO＜1者为阴性。;四、注意事项 ;五、 ELISA的影响因素;（一）固相载体 ;（二）抗原;（三）试验样品;（四）结合物 ;（五）洗涤剂与稀释剂;（六）底物 （1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚； （2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。;（七）作用时间;（八）结果判断;(九)试验的重复性（精确度）; 4、以“比值”表示：求出被检标本的O.D值与一组阴性标本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 —————————————≥2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。 5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被