[]脑源性神经营养分子在大鼠骨癌痛中的作用及其神经免疫机制.pdf

脑源性神经营养因子在大鼠骨癌痛中的作用及其 神经免疫机制 中文摘要 基于我室改良的骨癌痛模型表明，脊髓 P2X4 特异性存在于小胶质细胞表面，且 其参与骨癌痛大鼠痛觉过敏的形成。此外，近年来研究表明，脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经元-胶质细胞间对话的重要信号分 子，这一神经痛后异常分泌的 BDNF 是由小胶质细胞上 P2X4 激活实现的。作为与神 经痛相似又有其独特性的疼痛，骨癌痛状态下尚未发现存在类似 BDNF 介导的改变。 据此，我们推测，脊髓小胶质细胞 P2X4 受体激活介导的 BDNF 释放可能参与骨癌痛 痛敏的发生。本研究将结合在体、离体实验，采用 siRNA、行为学，real-time PCR ， Western Blot ，ELISA ，免疫组化等方法，通过分子水平（P2X4 受体和 BDNF ）、细胞 水平（小胶质细胞和神经元）以及整体水平（免疫和感觉系统）的对话来初探疼痛 的神经免疫机制。 [关键词] 脑源性神经生长因子(BDNF) ；P2X4 受体；骨癌痛；神经免疫机制；大鼠 第一部分 脑源性神经营养因子参与大鼠骨癌痛的发生 目的和方法 探讨脑源性神经营养因子 （Brain-derived neurotrophic factor，BDNF ） 在大鼠骨癌痛发生中的作用及其神经免疫机制。应用 Walker 256 乳腺癌细胞种植于大 鼠一侧胫骨髓腔，建立骨癌痛模型，并通过疼痛行为学、影像学、病理组织学等评估 肿瘤及疼痛发生发展情况；以下按照下述研究目的进行相应的实验分组，并分别采用 疼痛行为学（n=10 ），Western blots （n=4 ）， Real-time PCR （n=4 ），免疫组织化学（n=4 ）， 小 RNA 干扰（small interfering RNA ，siRNA ，n=4) 技术以及磺基罗丹明 B (sulforhodamine B，SRB)方法（n=6 ）进行研究： ①观察骨癌痛大鼠脊髓及背根神经 节（DRG ）BDNF 表达产物的变化；②观察小胶质细胞抑制剂米络环素对骨癌痛大鼠 I 脊髓 BDNF 表达的调节作用及其镇痛效应；③研究 BDNF 中和抗体对大鼠骨癌痛的 镇痛效应及其下游磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶 1/2 （phosphorylation of extracellular signal-regulated protein kinase1/2，p-ERK1/2 ）机制；④ 针对小胶质细胞 上 BDNF 表达的 siRNA 筛选及转染复合物的毒性检测；⑤观察 BDNFsiRNA 对骨癌 痛大鼠的镇痛效应及其可能机制。 结果 ①骨癌痛大鼠 L4～6 脊髓后角和 DRG 的 BDNF mRNA 及蛋白表达均增加，且峰值在造模后第 6 天(n = 4， P 0.01) ；② 早 期（造模后第 4～6 天连续注射）鞘内注射米诺环素可明显减缓大鼠骨癌痛（机械撤 爪阈值 PWT 及行走评分 ambulatory scores ）(n=10， P0.01) ；并减缓骨癌痛大鼠脊 髓后角的 OX-42 （小胶质细胞激活标志物）和BDNF 的表达；而晚期给药（造模后 第 10～12 天连续注射）则无显著作用；荧光免疫组化显示，造模后第 6 天，骨癌痛 大鼠 L4～6 脊髓后角 OX-42 表达上调；且 OX-42/BDNF 双标产物也上调。③鞘内注 射 BDNF 中和抗体减缓骨癌痛大鼠机械痛敏(机械撤爪阈值 PWT) (n=10 ， P0.01) ； 并 显 著 减 少 脊 髓 BDNF 和 p-ERK1/2 的 蛋 白 表 达 (n=4 ， 均 P0.01) ； ④LipofectamineTM2000 8µl 复合 100nmol siRNA （脂质体与siRNA 比例为 1：3 ），不 仅细胞毒性低而且转染效率高（n=6 ，P0.01 ），为最佳转染条件；与阴性对照组及 siRNA283、siRNA232 相比，BDNF siRNA1588 （100nmol，脂质体与 siRNA 比例 1： 3 ）干扰小胶质细胞