试剂的选用和配置不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗.PDFVIP

一、试剂的选用和配置： 不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗膜液不同。 本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。 变性液/碱性转移缓冲液（应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移）  0.4mol/L NaOH  1mol/L NaCl  配 2×母液 1L。 中和缓冲溶液Ⅱ（只用于碱性转移）  0.5mol/L Tris­Cl (pH 7.2)  1mol/L NaCl  20×SSC  800ml H O溶解 175.3g NaCl和 88.2g柠檬酸钠， 用几滴 14mol/LHCl调 pH 至 7.0， 2 用水定容至 1L。分装后高压灭菌，试剂终浓度为 3.0mol/L NaCl和 0.3mol/L 柠檬 酸钠。  10%(m/V) SDS  配制时 68℃加热助溶，浓盐酸调 pH 至 7．2，定容室温保存。（pH 极易调过， 需小心！） 二、技术操作步骤： Ⅰ、DNA 酶切和低压电泳： 概述：酶切所需 DNA 的量为 10μg～30μg，所需限制性内切酶量为 10Unit 酶/1μg  DNA，neb  公司的限制性内切酶的最佳酶切条件为  50μl  体系酶切  1～  2μgDNA。为了避免型号活性，注意所加酶的甘油含量和盐分含量 （glycerol  concentration  5%, or pH  8.0 may result in star activity 酶储液含 50% glycerol， 因而酶最大用量不能超过酶切体系的 10%），同时，选择内切酶时要注意其 可能因甲基化的敏感性导致基因组酶切效果不好。  1、400μl 的酶切反应体系：（10～30μg）  30 μg DNA 酶 300 U 37℃酶切 16h。 电泳检测酶切效果。1/10  体积 （40μl）3 mol/L  醋酸钠  2.5  倍体积的冷无水乙醇 （或  0.6～1 倍体积的遇冷异丙醇）­20℃沉淀  DNA，70%乙醇洗涤沉淀，溶解于25μl 1×TE。  2、荧光定量测定浓度后，加入 5μl 6×上样缓冲溶液，56℃水浴 5min，迅速置 于冰上 2min，以破坏粘性末端可能形成的碱基对。1×TAE 或 0.5×TBE 电泳缓 冲液和 0.8%的琼脂糖凝胶以小于 1V/cm 的电压电泳 12h。 由于 DNA 在凝胶中会 扩散，因而最好不要将凝胶放置超过一天。（楼下电泳仪一般用30V）  3、修去凝胶边缘和加样孔上不平整的无用部分，加样孔端朝下，凝胶左下角  Marker侧，切去一小三角，作为凝胶方位的标记。 对于大于 15kb 的条带，可采用将凝胶置于 0.2mol/L 的HCl 中数分钟，直到溴酚 蓝变黄，二甲苯青变成黄色/绿色后，迅速将 HCl 倒入废液缸，去离子水洗涤数 次。（强酸导致DNA脱嘌呤，而有利于转膜。但是，过度会导致 DNA 断裂成较 小片段。） Ⅱ、DNA 的变性、转膜装置组装和转膜：  1、带电荷的尼龙膜： 将凝胶浸入数倍体积的碱性转移缓冲溶液中，室温振荡 15min。 更换一次碱性缓冲溶液继续浸泡 20min。  2、切一张每边比凝胶大 1mm 的尼龙膜，并剪两张同样大小的厚吸水纸。（注意： 需带一次性 PE 手套和钝头镊子，沾有油污的膜不易浸湿。）  3、将膜飘浮于盛有去离子水的平皿中，直到其完全浸湿后，将其浸入适当的转 移缓冲溶液中至少 5min，用干净的解剖刀切下膜的一角，与凝胶所切下的角 一致。（注意：膜的浸湿完全与否，对 DNA 的转移至关重要。浸湿的膜可保 存在高压的 2×SSC饱和的 3MM 滤纸中，4℃保存。）  4、将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或平皿上，形成比凝胶长且宽的支持 物。将支持物或皿放入一个大的干烤皿中，吸水纸两端从板边缘垂下。  5、干烤皿中加入适当的转移缓冲液，直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持 物上的吸水纸完全浸湿后，用玻璃棒赶走吸水纸下的气泡。  6、将凝胶从变性液/碱性缓冲液中取出，倒转使原来的底面向上。放在支持物上， 并位于吸水纸中央。用玻璃棒赶走凝胶与吸水纸间的气泡。  7、用 Parafilm 膜包绕凝胶四周，不要覆盖凝胶。以屏蔽转移缓冲液从凝胶周围 短路流入吸水纸。  8、用适当的转移缓冲溶液将凝胶湿润。将湿润的尼龙膜放置于凝胶上并使两者 的切角相重叠。为避免产生气泡，当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜 放到凝胶上。膜的一边应恰好超过